4.5: Трансвелловый миграционный анализ

Анализ трансвеллальной миграции является классическим методом, который позволяет ученым количественно оценить движение клеток. Миграция относится к способности клетки перемещаться по отдельности или кластерами. Движение клеток стало возможным благодаря точной перестройке их цитоскелета, а миграция обычно происходит в ответ на стимулы, которые действуют как сигналы.

Сегодня мы обсудим анализ миграции трансвелла, в котором используется простая конфигурация камеры для оценки миграции в ответ на сигналы притяжения.

Мы начнем с предоставления некоторой справочной информации о трансвелл-камере.

Аппарат был впервые разработан доктором Стивеном Бойденом в 1961 году, который использовал его для изучения миграции лейкоцитов. Поэтому этот метод также известен как камерный анализ Бойдена.

В простой камере Бойдена наружная стена состоит из колодцев, как в 96-луночной пластине. Внутри каждой лунки помещается трансвелл, представляющий собой цилиндрическую вставку. Вставка имеет поликарбонатную мембрану с определенным размером пор. При помещении в колодец он делит камеру на два отсека. В верхнем отсеке будут засеяны клетки, миграционное поведение которых будет изучено, а в нижнем резервуаре будет помещен раствор хемоаттрактанта. По определению, хемоаттрактант — это молекула, которая обладает способностью способствовать подвижности клеток путем «привлечения клеток».

Из-за этих сил притяжения клетки в верхнем отсеке мигрируют через поры в нижний резервуар. Если клетки обладают адгезивными свойствами, как некоторые клетки меланомы, то после движения они будут «прилипать» к нижней стороне мембраны. В этом случае мембрана может быть зафиксирована, окрашена, а клетки подсчитаны под микроскопом. С другой стороны, неадгезивные клетки, такие как сперматозоиды, будут мигрировать в донный резервуар. В этом случае клетки в резервуарном растворе можно подсчитать с помощью гемоцитометра.

Несмотря на то, что настройка для этого анализа проста, есть несколько моментов, которые необходимо учесть перед экспериментом. Давайте рассмотрим некоторые из них.

Начиная с решения для посева, вы должны убедиться, что плотность оптимизирована, чтобы наблюдать за миграцией клеток. Слишком малое количество клеток может привести к необнаруживаемой миграции, а большая плотность приведет к перенаселению мембраны, что затруднит перечисление миграции. Вторым фактором является размер пор вставки. Его следует тщательно подбирать в зависимости от типа клетки. Если размер пор слишком мал, клетки не смогут пройти через них.

С другой стороны, если размер пор слишком велик, клетки просто провалятся, что не является миграцией. Наконец, следует помнить о концентрации хемоаттрактанта и времени инкубации, которое должно быть отведено для миграции, поскольку они взаимозависимы. Оптимальная концентрация с соответствующим временем инкубации, в течение которого сохраняется градиент концентрации между компартментами, индуцирует миграцию клеток за счет химиопритяжения. И наоборот, длительная инкубация может сопровождаться уравновешиванием хемоаттрактанта по всей камере, что приводит к потере химического градиента, что может исказить анализ полученных результатов.

Учитывая эти соображения, давайте обсудим протокол, используемый для измерения миграции адгезивных клеток.

Анализируемые клетки получают в среде, не содержащей протеазы, так как протеазы могут денатурировать важные мембранные рецепторы и в конечном итоге влиять на миграцию. После того, как ячейки будут подготовлены, суспензию следует развести до оптимальной плотности посева. Для того чтобы подготовить камеру, трансвеллы помещаются в лунки на многолуночной пластине. Клеточную суспензию следует пипетировать в транслунл, не касаясь мембраны и не вводя пузырьков воздуха.

Раствор хемоаттрактанта пипетируется в нижний резервуар, следя за тем, чтобы раствор соприкасался с мембраной вкладыша. Время инкубации для миграции будет зависеть от экспериментальных соображений. После инкубации мембраны фиксируются путем погружения вкладыша в 70% этанол. Дав вкладышу высохнуть, добавляется раствор для окрашивания клеток.

Далее клетки инкубируются в течение примерно 30 минут при комнатной температуре. После инкубации вкладыши промываются с помощью промывочного буфера. Наконец, мембрану можно иссечь и поместить на предметное стекло микроскопа. Клетки на нижней стороне мембраны представляют собой количество клеток, которые мигрировали в присутствии и в отсутствие хемоаттрактантов.

Теперь, когда вы уже знакомы с протоколом, давайте кратко рассмотрим, как исследователи используют этот метод в своих исследованиях.

Одним из наиболее распространенных применений этого анализа является оценка хемоаттрактантных свойств неизвестных соединений. Здесь ученых заинтересовало изучение путей плавания сперматозоидов лягушек в присутствии аллурина, который является веществом, выделяемым яйцами амфибий. Для этого они сначала пипетировали активные сперматозоиды лягушки в верхнюю часть трансвелловых вставок. На дно добавили аллурин. Позволив клеткам мигрировать, они подсчитали сперматозоиды в резервуарном растворе под микроскопом. Используя эту методику, они смогли создать кривую концентрация-реакция, отражающую влияние концентрации аллурина на миграцию сперматозоидов.

Когда клетка подвергается атаке патогенов, она посылает хемоаттрактанты для привлечения иммунных клеток, которые мигрируют, прикрепляются и впоследствии разрешают инфекцию. Чтобы проверить это явление, ученые культивировали эпителиальные клетки на нижней стороне вставок. Впоследствии они заразили эти клетки разными штаммами бактерий. Наконец, они ввели иммунные клетки в верхнюю камеру. Известно, что инфицированные клетки продуцируют несколько хемоаттрактантов, которые индуцируют миграцию иммунных клеток. Результаты этого эксперимента продемонстрировали разную степень миграции нейтрофилов в ответ на различные типы бактериальной инфекции.

Наконец, инвазия раковых клеток и метастазирование через внеклеточный матрикс всегда интриговали клеточных биологов. Здесь ученые хотели определить, как конкретные хемоаттрактанты могут способствовать такой миграции через 3D-матрицу. Они генетически сконструировали два отдельных пула клеток: один экспрессирует зеленый флуоресцентный, а другой красный флуоресцентный белок. Затем они пипетировали внеклеточный матрикс, имитирующий верхнюю часть трансвеллов.

После затвердевания они инвертировали трансвелл и засеяли два пула клеток на нижней стороне мембраны. Затем они заменили вставку в многолуночный планшет и направили раствор хемоаттрактанта пипетом в верхнюю камеру. Это заставило клетки внизу двигаться вверх и через 3D-матрицу. С помощью конфокальной визуализации эти исследователи реконструировали миграцию клеток в 3D и выделили модели миграции двух групп клеток.

Вы только что посмотрели видео JoVE об анализе миграции трансвеллов. Теперь, когда вы понимаете компоненты и протокол этого метода, вы знаете, почему он так широко используется клеточными биологами. Несмотря на простоту этой конфигурации, диапазон конфигураций, которые может адаптировать этот метод, делает его незаменимым для исследований подвижности клеток. Как всегда, спасибо за просмотр!