Оценки в Vitro повреждения ДНК, используя Assay комета

Общая цель этого эксперимента заключается в исследовании эффективности генотоксических агентов в раковых клетках с помощью анализа электрофореза одной клетки, который также называется анализом кометы. Эта процедура представляет собой смысл для измерения четырех генетических токсикологических исследований. И это применимо к различным аспектам, таким как ранний отбор кандидатов в лекарства и фундаментальные исследования в области повреждения и репарации ДНК.

Этот метод обеспечивает прямой способ количественной оценки повреждений ДНК. Кроме того, он эффективен, прост в исполнении и относительно недорог. Подготовьте агарозу для скользящего покрытия, расплавив одну процентную агарозу в микроволновой печи в течение двух-трех минут или до полного расплавления агарозы.

Опустите предметное стекло стеклянного микроскопа в агарозу и с помощью безворсовой салфетки протрите одну сторону предметного стекла. Положите предметное стекло на ровную поверхность для сушки на воздухе. Прозрачная агарозная пленка должна образоваться после высыхания.

Перед использованием поместите предметные стекла с покрытием при температуре 37 градусов Цельсия. Терапевтический эффект химиотерапии оценивают на клетках глиомы U251, культивируемых в среде DMEM/Ham F-12 с добавлением 10% FBS, 100 ЕД на миллилитр пенициллина и 10 мкг на миллилитр стрептомицина. Расщепляйте клетки с помощью одного миллилитра трипсина в течение трех минут, а затем нейтрализуйте трипсин с помощью среды DMEM/Ham F-12 с FBS.

Соберите клетки в пробирку объемом 15 миллилитров. И вращайте со скоростью 300 перегрузок в течение четырех минут. Отсасывайте среду.

И суспендировать клетки в соотношении от двух до 10 до пятой клетки на миллилитр в 1x PBS. Клетки и должны быть подготовлены непосредственно перед началом анализа. А обрабатывать их следует в темное время суток.

Все при тусклом освещении, чтобы предотвратить повреждение. Соедините клеточную суспензию с однопроцентной расплавленной агарозой с низкой температурой плавления в объемном соотношении один к 10. Аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.

И сразу же нанесите пипеткой 30 микролитров на предметное стекло. С помощью предметного стекла наконечника пипетки распределите агарозную смесь, чтобы обеспечить образование тонкого слоя. Поместите предметные стекла на плоскую поверхность при температуре четыре градуса Цельсия в темноте на 10 минут.

Погрузите предметные стекла в четырехградусный раствор лизиса Цельсия, в темноте на час или на ночь. Для анализа щелочных комет аккуратно удалите предметные стекла из раствора лизиса, слейте лишнюю жидкость и осторожно погрузите предметные стекла в AES в темноте при температуре четыре градуса Цельсия на один час, чтобы дать возможность раскрутить ДНК. Добавьте предварительно охлажденный AES в лоток для предметного стекла для электрофореза.

Не превышайте 0,5 сантиметра над горками. Поместите горки внутрь и накройте крышкой. Установите напряжение источника питания на один вольт на сантиметр и работайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут.

Когда электрофорез будет завершен, слейте излишки AES со стекол. Каждый раз осторожно погружайте предметные стекла дважды в дистиллированную воду комнатной температуры на пять минут. После этого аккуратно погрузите горки в 70% этанол комнатной температуры на пять минут.

Для анализа нейтральной кометы аккуратно удалите предметные стекла из раствора для лизиса, слейте лишнюю жидкость и осторожно погрузите в NES в темноте, при температуре четыре градуса Цельсия, на 30 минут. Добавьте предварительно охлажденный NES в лоток для предметных стекол с электрофорезами, не превышающий 0,5 сантиметра над предметными стеклами. Поместите горки внутрь и накройте крышкой.

Установите напряжение источника питания на один вольт на сантиметр и работайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 45 минут. Слейте лишний буфер с горок. Аккуратно погрузите предметные стекла в раствор осаждения ДНК при комнатной температуре на 30 минут.

Через 30 минут аккуратно погрузите горки в 70% этанол при комнатной температуре на 30 минут. Начните эту процедуру с сушки предметных стекол в темноте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10-15 минут. Далее нанесите 50-100 микролитров зеленого флуоресцентного раствора для окрашивания нуклеиновых кислот на высушенную агарозу каждого предметного стекла и окрашивайте в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.

Кратко промойте предметные стекла в дистиллированной воде и полностью высушите при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. Выполняйте получение и анализ изображений сразу после окрашивания стекол кометы. Поместите предметное стекло под флуоресцентный микроскоп с держателем предметного стекла.

Выберите объектив с 10-кратным увеличением и убедитесь, что агарозный гель направлен на линзу объектива. Случайным образом захватывайте изображения с каждого окрашенного слайда кометы. Избегайте краев и областей вокруг пузырьков воздуха.

Убедитесь, что каждый хвост кометы распределен горизонтально. Головы комет должны начинаться слева, а хвост – справа. Сохраняйте каждую картинку в двоичном формате с ярким пятном ДНК и темным фоном.

Для анализа изображений сначала загрузите все изображения в программное обеспечение для анализа комет с помощью кнопки «Выбрать файлы для анализа», расположенной в левой части панели инструментов. Должно появиться окно просмотра изображения. Нарисуйте на экране рамку измерения, и отрегулируйте ее размер в соответствии с кометой клетки.

Нажмите «Настроить», чтобы установить порог для головы, кометы и хвоста в соответствии с изображением. А затем нажмите кнопку Начать измерения. Выберите ячейку с помощью рамки и активируйте измерение, нажав на кнопку «Анализ кометы».

В окне профилей появится изображение интенсивности с выбранными параметрами измерения. Сохраните результаты, нажав кнопку «Сохранить результаты». Анализируйте не менее 50 клеток за одну процедуру.

Результаты анализа щелочных и нейтральных комет показывают, что кометные хвосты обработанных доксорубицином клеток UT51 были длиннее и имели более высокую интенсивность ДНК, что свидетельствует о значительном накоплении фрагментированной ДНК. Количественный анализ для анализа щелочной или нейтральной кометы показал значительно увеличенное образование хвоста кометы после обработки доксорубицином, что указывает на повреждение ДНК. Комбинированное лечение ингибитором PARP, олапорибом, и алкилирующим агентом, темозоломидом, значительно усилило повреждение ДНК в клетках глиомы, что отражается в увеличении длины и интенсивности сигнала хвоста кометы.

Олапориб сам по себе не приводил к повреждению ДНК. Где как он потенцирует генотоксическое действие темозоломида. Репрезентативные изображения клеток глиомы при однократном и комбинированном лечении показали более длинные и интенсивные кометные хвосты клеток, обработанных темозоломидом и олапорибом.

После освоения этой техники ее можно сделать за пять часов, если она выполнена правильно. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области генотоксичности для измерения разрывов нитей ДНК во многих типах укариотических клеток. Например, культивируемые клетки или клетки, выделенные из организмов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать анализ комет для исследования эффективности генотоксического агента на уровне отдельных клеток. Не забывайте, что работа с реагентом для нанесения повреждений может быть крайне опасной. И меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата и перчаток, всегда должны приниматься во время проведения этой процедуры.