Биотинилирование клеточной поверхности

Мечение белков клеточной поверхности биотином представляет собой мощный инструмент для изучения клеточных транспортных путей, участвующих в регуляции мембранных белков. Клетка поддерживает строго регулируемый набор белков на поверхности, так что она может получать внеклеточную информацию и реагировать на нее через несколько сигнальных путей. Предполагается, что эндоцитоз, процесс поглощения, участвует в регуляции этих белков клеточной поверхности, вызывая их интернализацию. Таким образом, маркировка этих белков до того, как они будут эндоцитозированы, с помощью таких агентов, как биотин, помогает ученым количественно оценить их интернализацию и изучить их роль в клеточных путях.

В этом видео мы обсудим принципы и методологию анализа биотинилирования клеточной поверхности, а также исследуем некоторые способы, с помощью которых ученые адаптируют этот метод сегодня.

Давайте сначала рассмотрим принципы, лежащие в основе анализа биотинилирования клеточной поверхности.

Как упоминалось ранее, клетки используют эндоцитарные пути для регулирования пространственно-временной плотности и распределения поверхностных белков. Интернализованные белки транспортируются по определенным клеточным путям, после чего они могут быть либо шунтированы к лизосоме для деградации, либо возвращены на поверхность клетки для продолжения активности. Биотинилирование клеточной поверхности предназначено для измерения этих процессов.

Метка, используемая в этом анализе, биотин, также известный как витамин H, представляет собой небольшую водорастворимую молекулу. Обычно используемым производным биотина для экспериментов по поверхностному мечению является сульфо-NHS-SS-биотин, который состоит из сульфогруппы, N-гидроксисукцинимидной эфирной группы, дисульфидной связи и, конечно же, биотина. Упростим эту огромную структуру, заменив биотин на букву «В».

Сульфогруппа в этой структуре придает сильный заряд, который делает эту форму биотиновой мембраны непроницаемой. Мечение белков клеточной поверхности осуществляется путем добавления сульфо-NHS-SS-биотина в клетки, поддерживаемые при температуре, ограничивающей эндоцитоз. Группа NHS реагирует с первичными аминами на поверхностных белках, образуя ковалентные связи.

Затем меченые клетки перемещаются до температуры, позволяющей эндоцитозу, во время которой некоторые из меченых белков будут интернализованы. Наконец, клетки возвращаются к ограничительной температуре, чтобы остановить эндоцитоз. Для того, чтобы конкретно количественно определить интернализованные белки, добавляют гидрофильный, непроницаемый для мембраны восстановитель, такой как L-глутатион. Это вступает в реакцию с дисульфидными связями на неэндоцитозированном сульфо-NHS-SS биотине и расщепляет биотиновые группы. На этом этапе оставшимися биотинилированными белками являются те, метки которых были защищены от восстановителя, поскольку они были ранее интернализованы.

Затем клетки лизируют, и эндоцитозированные биотинилированные белки выделяют для количественного определения. Выделение обычно выполняется путем добавления клеточных лизатов к синтетическим гранулам, покрытым стрептавидином. Поскольку стрептавидин обладает чрезвычайно высоким сродством к биотину, биотинилированные белки прикрепляются к покрытым им гранулам. Серия этапов промывки для удаления загрязняющих белков и, наконец, стадия элюирования для высвобождения связанных белков. Затем целевые белки могут быть проанализированы с помощью таких методов, как вестерн-блоттинг.

Поскольку теперь вы знакомы с концепциями, стоящими за анализом биотинилирования, давайте рассмотрим обобщенный протокол, показывающий, как выполнять эту процедуру для измерения эндоцитоза поверхностных белков.

Начните с культивируемых клеток, охлажденных до 4°C. Поместите их на лед, чтобы поддерживать температуру, ограничивающую эндоцитоз. Затем добавляется мембранный непроницаемый реагент сульфо-NHS-SS-биотин, и клетки инкубируются в темноте в течение примерно 30 минут. Это дает достаточно времени для ковалентного прикрепления меток биотина к поверхностным белкам. Затем клетки извлекают изо льда и инкубируют при температуре 37°C в течение примерно 30 минут. При этой температуре происходит эндоцитоз биотинилированных поверхностных белков. После инкубации клетки охлаждают до 4°C и добавляют гидрофильный восстановитель, такой как L-глутатион. Он вступает в реакцию с дисульфидными связями и высвобождает биотиновые группы из меченых, неэндоцитозированных белков.

Затем клетки лизируются центрифугированием, тем самым разрушая клеточные мембраны и подвергая воздействию биотинилированные белки. После этого к гранулам, покрытым стрептавидином, добавляются лизаты и биотинилированные белки вступают в связь. Шарики промываются холодным фосфатным буфером и элюируются буфером, содержащим моющие и восстановительные вещества. Эти реагенты денатурируют связанные белки с гранул и способствуют их восстановлению в элюате. Белки в элюате разделяются на основе их молекулярной массы с помощью гель-электрофореза. Наконец, вестерн-блоттинг и зондирование блоттинга белок-специфическими антителами позволяют визуализировать целевой белок. Процент эндоцитозированного белка может быть количественно определен на основе результирующей плотности полосы.

Теперь, когда вы понимаете методологию биотинилирования клеток, давайте посмотрим, как она используется в конкретных экспериментах.

Наиболее распространенным применением этого протокола биотинилирования является измерение эндоцитарной скорости специфических белков клеточной поверхности. Здесь ученых заинтересовала оценка интернализации транспортера дофамина или DAT. Следуя стандартному протоколу, ученые смогли измерить процент эндоцитозированных DAT. Это репрезентативный иммуноблоттинг, показывающий полосу T, соответствующую «общему» количеству белка до интернализации, полоса S предназначена для «очищенных» образцов, в которых клеткам никогда не позволяли пройти через эндоцитоз, а обрабатывали восстановителем, а полоса I представляет результаты «интернализованных» белков.

В дополнение к измерению эндоцитоза поверхностных белков, ученые также изучают влияние лекарств на этот процесс. В этом исследовании ученые оценивали поверхностную плотность DAT в ответ на обработку активатором протеинкиназы C (PKC), действие которого, как предполагается, индуцирует интернализацию DAT. Ученые подтвердили это, адаптировав протокол биотинилирования in vitro для использования в анализе ex vivo на тканях мозга мышей. Данные показали потерю примерно 30% DAT из клеточной мембраны в ответ на активацию PKC.

Наконец, настроив анализ биотинилирования, ученые также могут измерить рециркуляцию мембранных белков. Здесь исследователи изучали белок поверхностного канала, CFTR, ответственный за проведение ионов хлора. Чтобы оценить рециркуляцию, исследователи выполнили стандартный протокол биотинилирования в одной группе клеток и модифицировали протокол для второй группы клеток, добавив шаги после отщепления биотина от неэндоцитозированных поверхностных белков. Эти дополнительные шаги включали повышение температуры до 37°C, чтобы обеспечить рециркуляцию некоторых интернализованных, меченных биотином рецепторных белков. Рассчитав разницу между интернализованными белками до и после рециркуляции, эти ученые смогли количественно оценить процент CFTR, возвращенного обратно в мембрану.

Вы только что посмотрели введение JoVE в анализ биотинилирования клеточной поверхности. В видео описывались процедурные этапы этого анализа и объяснялась реакция, происходящая на каждом этапе. Наконец, мы рассмотрели несколько примеров экспериментов, которые продемонстрировали применимость этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!