Биотинилирование клеточной поверхности
Мечение белков клеточной поверхности биотином представляет собой мощный инструмент для изучения клеточных транспортных путей, участвующих в регуляции мембранных белков. Клетка поддерживает строго регулируемый набор белков на поверхности, так что она может получать внеклеточную информацию и реагировать на нее через несколько сигнальных путей. Предполагается, что эндоцитоз, процесс поглощения, участвует в регуляции этих белков клеточной поверхности, вызывая их интернализацию. Таким образом, маркировка этих белков до того, как они будут эндоцитозированы, с помощью таких агентов, как биотин, помогает ученым количественно оценить их интернализацию и изучить их роль в клеточных путях.
В этом видео мы обсудим принципы и методологию анализа биотинилирования клеточной поверхности, а также исследуем некоторые способы, с помощью которых ученые адаптируют этот метод сегодня.
Давайте сначала рассмотрим принципы, лежащие в основе анализа биотинилирования клеточной поверхности.
Как упоминалось ранее, клетки используют эндоцитарные пути для регулирования пространственно-временной плотности и распределения поверхностных белков. Интернализованные белки транспортируются по определенным клеточным путям, после чего они могут быть либо шунтированы к лизосоме для деградации, либо возвращены на поверхность клетки для продолжения активности. Биотинилирование клеточной поверхности предназначено для измерения этих процессов.
Метка, используемая в этом анализе, биотин, также известный как витамин H, представляет собой небольшую водорастворимую молекулу. Обычно используемым производным биотина для экспериментов по поверхностному мечению является сульфо-NHS-SS-биотин, который состоит из сульфогруппы, N-гидроксисукцинимидной эфирной группы, дисульфидной связи и, конечно же, биотина. Упростим эту огромную структуру, заменив биотин на букву «В».
Сульфогруппа в этой структуре придает сильный заряд, который делает эту форму биотиновой мембраны непроницаемой. Мечение белков клеточной поверхности осуществляется путем добавления сульфо-NHS-SS-биотина в клетки, поддерживаемые при температуре, ограничивающей эндоцитоз. Группа NHS реагирует с первичными аминами на поверхностных белках, образуя ковалентные связи.
Затем меченые клетки перемещаются до температуры, позволяющей эндоцитозу, во время которой некоторые из меченых белков будут интернализованы. Наконец, клетки возвращаются к ограничительной температуре, чтобы остановить эндоцитоз. Для того, чтобы конкретно количественно определить интернализованные белки, добавляют гидрофильный, непроницаемый для мембраны восстановитель, такой как L-глутатион. Это вступает в реакцию с дисульфидными связями на неэндоцитозированном сульфо-NHS-SS биотине и расщепляет биотиновые группы. На этом этапе оставшимися биотинилированными белками являются те, метки которых были защищены от восстановителя, поскольку они были ранее интернализованы.
Затем клетки лизируют, и эндоцитозированные биотинилированные белки выделяют для количественного определения. Выделение обычно выполняется путем добавления клеточных лизатов к синтетическим гранулам, покрытым стрептавидином. Поскольку стрептавидин обладает чрезвычайно высоким сродством к биотину, биотинилированные белки прикрепляются к покрытым им гранулам. Серия этапов промывки для удаления загрязняющих белков и, наконец, стадия элюирования для высвобождения связанных белков. Затем целевые белки могут быть проанализированы с помощью таких методов, как вестерн-блоттинг.
Поскольку теперь вы знакомы с концепциями, стоящими за анализом биотинилирования, давайте рассмотрим обобщенный протокол, показывающий, как выполнять эту процедуру для измерения эндоцитоза поверхностных белков.
Начните с культивируемых клеток, охлажденных до 4°C. Поместите их на лед, чтобы поддерживать температуру, ограничивающую эндоцитоз. Затем добавляется мембранный непроницаемый реагент сульфо-NHS-SS-биотин, и клетки инкубируются в темноте в течение примерно 30 минут. Это дает достаточно времени для ковалентного прикрепления меток биотина к поверхностным белкам. Затем клетки извлекают изо льда и инкубируют при температуре 37°C в течение примерно 30 минут. При этой температуре происходит эндоцитоз биотинилированных поверхностных белков. После инкубации клетки охлаждают до 4°C и добавляют гидрофильный восстановитель, такой как L-глутатион. Он вступает в реакцию с дисульфидными связями и высвобождает биотиновые группы из меченых, неэндоцитозированных белков.
Затем клетки лизируются центрифугированием, тем самым разрушая клеточные мембраны и подвергая воздействию биотинилированные белки. После этого к гранулам, покрытым стрептавидином, добавляются лизаты и биотинилированные белки вступают в связь. Шарики промываются холодным фосфатным буфером и элюируются буфером, содержащим моющие и восстановительные вещества. Эти реагенты денатурируют связанные белки с гранул и способствуют их восстановлению в элюате. Белки в элюате разделяются на основе их молекулярной массы с помощью гель-электрофореза. Наконец, вестерн-блоттинг и зондирование блоттинга белок-специфическими антителами позволяют визуализировать целевой белок. Процент эндоцитозированного белка может быть количественно определен на основе результирующей плотности полосы.
Теперь, когда вы понимаете методологию биотинилирования клеток, давайте посмотрим, как она используется в конкретных экспериментах.
Наиболее распространенным применением этого протокола биотинилирования является измерение эндоцитарной скорости специфических белков клеточной поверхности. Здесь ученых заинтересовала оценка интернализации транспортера дофамина или DAT. Следуя стандартному протоколу, ученые смогли измерить процент эндоцитозированных DAT. Это репрезентативный иммуноблоттинг, показывающий полосу T, соответствующую «общему» количеству белка до интернализации, полоса S предназначена для «очищенных» образцов, в которых клеткам никогда не позволяли пройти через эндоцитоз, а обрабатывали восстановителем, а полоса I представляет результаты «интернализованных» белков.
В дополнение к измерению эндоцитоза поверхностных белков, ученые также изучают влияние лекарств на этот процесс. В этом исследовании ученые оценивали поверхностную плотность DAT в ответ на обработку активатором протеинкиназы C (PKC), действие которого, как предполагается, индуцирует интернализацию DAT. Ученые подтвердили это, адаптировав протокол биотинилирования in vitro для использования в анализе ex vivo на тканях мозга мышей. Данные показали потерю примерно 30% DAT из клеточной мембраны в ответ на активацию PKC.
Наконец, настроив анализ биотинилирования, ученые также могут измерить рециркуляцию мембранных белков. Здесь исследователи изучали белок поверхностного канала, CFTR, ответственный за проведение ионов хлора. Чтобы оценить рециркуляцию, исследователи выполнили стандартный протокол биотинилирования в одной группе клеток и модифицировали протокол для второй группы клеток, добавив шаги после отщепления биотина от неэндоцитозированных поверхностных белков. Эти дополнительные шаги включали повышение температуры до 37°C, чтобы обеспечить рециркуляцию некоторых интернализованных, меченных биотином рецепторных белков. Рассчитав разницу между интернализованными белками до и после рециркуляции, эти ученые смогли количественно оценить процент CFTR, возвращенного обратно в мембрану.
Вы только что посмотрели введение JoVE в анализ биотинилирования клеточной поверхности. В видео описывались процедурные этапы этого анализа и объяснялась реакция, происходящая на каждом этапе. Наконец, мы рассмотрели несколько примеров экспериментов, которые продемонстрировали применимость этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!
Клетка может регулировать количество определенных белков на своей клеточной мембране с помощью эндоцитоза, после чего белки клеточной поверхности эффе…
Мечение белков клеточной поверхности биотином представляет собой мощный инструмент для изучения клеточных транспортных путей, участвующих в регуляции мембранных белков. Клетка поддерживает строго регулируемый набор белков на поверхности, так что она может получать внеклеточную информацию и реагировать на нее через несколько сигнальных путей. Предполагается, что эндоцитоз, процесс поглощения, участвует в регуляции этих белков клеточной поверхности, вызывая их интернализацию. Таким образом, маркировка этих белков до того, как они будут эндоцитозированы, с помощью таких агентов, как биотин, помогает ученым количественно оценить их интернализацию и изучить их роль в клеточных путях.
В этом видео мы обсудим принципы и методологию анализа биотинилирования клеточной поверхности, а также исследуем некоторые способы, с помощью которых ученые адаптируют этот метод сегодня.
Давайте сначала рассмотрим принципы, лежащие в основе анализа биотинилирования клеточной поверхности.
Как упоминалось ранее, клетки используют эндоцитарные пути для регулирования пространственно-временной плотности и распределения поверхностных белков. Интернализованные белки транспортируются по определенным клеточным путям, после чего они могут быть либо шунтированы к лизосоме для деградации, либо возвращены на поверхность клетки для продолжения активности. Биотинилирование клеточной поверхности предназначено для измерения этих процессов.
Метка, используемая в этом анализе, биотин, также известный как витамин H, представляет собой небольшую водорастворимую молекулу. Обычно используемым производным биотина для экспериментов по поверхностному мечению является сульфо-NHS-SS-биотин, который состоит из сульфогруппы, N-гидроксисукцинимидной эфирной группы, дисульфидной связи и, конечно же, биотина. Упростим эту огромную структуру, заменив биотин на букву «В».
Сульфогруппа в этой структуре придает сильный заряд, который делает эту форму биотиновой мембраны непроницаемой. Мечение белков клеточной поверхности осуществляется путем добавления сульфо-NHS-SS-биотина в клетки, поддерживаемые при температуре, ограничивающей эндоцитоз. Группа NHS реагирует с первичными аминами на поверхностных белках, образуя ковалентные связи.
Затем меченые клетки перемещаются до температуры, позволяющей эндоцитозу, во время которой некоторые из меченых белков будут интернализованы. Наконец, клетки возвращаются к ограничительной температуре, чтобы остановить эндоцитоз. Для того, чтобы конкретно количественно определить интернализованные белки, добавляют гидрофильный, непроницаемый для мембраны восстановитель, такой как L-глутатион. Это вступает в реакцию с дисульфидными связями на неэндоцитозированном сульфо-NHS-SS биотине и расщепляет биотиновые группы. На этом этапе оставшимися биотинилированными белками являются те, метки которых были защищены от восстановителя, поскольку они были ранее интернализованы.
Затем клетки лизируют, и эндоцитозированные биотинилированные белки выделяют для количественного определения. Выделение обычно выполняется путем добавления клеточных лизатов к синтетическим гранулам, покрытым стрептавидином. Поскольку стрептавидин обладает чрезвычайно высоким сродством к биотину, биотинилированные белки прикрепляются к покрытым им гранулам. Серия этапов промывки для удаления загрязняющих белков и, наконец, стадия элюирования для высвобождения связанных белков. Затем целевые белки могут быть проанализированы с помощью таких методов, как вестерн-блоттинг.
Поскольку теперь вы знакомы с концепциями, стоящими за анализом биотинилирования, давайте рассмотрим обобщенный протокол, показывающий, как выполнять эту процедуру для измерения эндоцитоза поверхностных белков.
Начните с культивируемых клеток, охлажденных до 4°C. Поместите их на лед, чтобы поддерживать температуру, ограничивающую эндоцитоз. Затем добавляется мембранный непроницаемый реагент сульфо-NHS-SS-биотин, и клетки инкубируются в темноте в течение примерно 30 минут. Это дает достаточно времени для ковалентного прикрепления меток биотина к поверхностным белкам. Затем клетки извлекают изо льда и инкубируют при температуре 37°C в течение примерно 30 минут. При этой температуре происходит эндоцитоз биотинилированных поверхностных белков. После инкубации клетки охлаждают до 4°C и добавляют гидрофильный восстановитель, такой как L-глутатион. Он вступает в реакцию с дисульфидными связями и высвобождает биотиновые группы из меченых, неэндоцитозированных белков.
Затем клетки лизируются центрифугированием, тем самым разрушая клеточные мембраны и подвергая воздействию биотинилированные белки. После этого к гранулам, покрытым стрептавидином, добавляются лизаты и биотинилированные белки вступают в связь. Шарики промываются холодным фосфатным буфером и элюируются буфером, содержащим моющие и восстановительные вещества. Эти реагенты денатурируют связанные белки с гранул и способствуют их восстановлению в элюате. Белки в элюате разделяются на основе их молекулярной массы с помощью гель-электрофореза. Наконец, вестерн-блоттинг и зондирование блоттинга белок-специфическими антителами позволяют визуализировать целевой белок. Процент эндоцитозированного белка может быть количественно определен на основе результирующей плотности полосы.
Теперь, когда вы понимаете методологию биотинилирования клеток, давайте посмотрим, как она используется в конкретных экспериментах.
Наиболее распространенным применением этого протокола биотинилирования является измерение эндоцитарной скорости специфических белков клеточной поверхности. Здесь ученых заинтересовала оценка интернализации транспортера дофамина или DAT. Следуя стандартному протоколу, ученые смогли измерить процент эндоцитозированных DAT. Это репрезентативный иммуноблоттинг, показывающий полосу T, соответствующую «общему» количеству белка до интернализации, полоса S предназначена для «очищенных» образцов, в которых клеткам никогда не позволяли пройти через эндоцитоз, а обрабатывали восстановителем, а полоса I представляет результаты «интернализованных» белков.
В дополнение к измерению эндоцитоза поверхностных белков, ученые также изучают влияние лекарств на этот процесс. В этом исследовании ученые оценивали поверхностную плотность DAT в ответ на обработку активатором протеинкиназы C (PKC), действие которого, как предполагается, индуцирует интернализацию DAT. Ученые подтвердили это, адаптировав протокол биотинилирования in vitro для использования в анализе ex vivo на тканях мозга мышей. Данные показали потерю примерно 30% DAT из клеточной мембраны в ответ на активацию PKC.
Наконец, настроив анализ биотинилирования, ученые также могут измерить рециркуляцию мембранных белков. Здесь исследователи изучали белок поверхностного канала, CFTR, ответственный за проведение ионов хлора. Чтобы оценить рециркуляцию, исследователи выполнили стандартный протокол биотинилирования в одной группе клеток и модифицировали протокол для второй группы клеток, добавив шаги после отщепления биотина от неэндоцитозированных поверхностных белков. Эти дополнительные шаги включали повышение температуры до 37°C, чтобы обеспечить рециркуляцию некоторых интернализованных, меченных биотином рецепторных белков. Рассчитав разницу между интернализованными белками до и после рециркуляции, эти ученые смогли количественно оценить процент CFTR, возвращенного обратно в мембрану.
Вы только что посмотрели введение JoVE в анализ биотинилирования клеточной поверхности. В видео описывались процедурные этапы этого анализа и объяснялась реакция, происходящая на каждом этапе. Наконец, мы рассмотрели несколько примеров экспериментов, которые продемонстрировали применимость этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!
Мечение белков клеточной поверхности биотином представляет собой мощный инструмент для изучения клеточных транспортных путей, участвующих в регуляции мембранных белков. Клетка поддерживает строго регулируемый набор белков на поверхности, так что она может получать внеклеточную информацию и реагировать на нее через несколько сигнальных путей. Предполагается, что эндоцитоз, процесс поглощения, участвует в регуляции этих белков клеточной поверхности, вызывая их интернализацию. Таким образом, маркировка этих белков до того, как они будут эндоцитозированы, с помощью таких агентов, как биотин, помогает ученым количественно оценить их интернализацию и изучить их роль в клеточных путях.
В этом видео мы обсудим принципы и методологию анализа биотинилирования клеточной поверхности, а также исследуем некоторые способы, с помощью которых ученые адаптируют этот метод сегодня.
Давайте сначала рассмотрим принципы, лежащие в основе анализа биотинилирования клеточной поверхности.
Как упоминалось ранее, клетки используют эндоцитарные пути для регулирования пространственно-временной плотности и распределения поверхностных белков. Интернализованные белки транспортируются по определенным клеточным путям, после чего они могут быть либо шунтированы к лизосоме для деградации, либо возвращены на поверхность клетки для продолжения активности. Биотинилирование клеточной поверхности предназначено для измерения этих процессов.
Метка, используемая в этом анализе, биотин, также известный как витамин H, представляет собой небольшую водорастворимую молекулу. Обычно используемым производным биотина для экспериментов по поверхностному мечению является сульфо-NHS-SS-биотин, который состоит из сульфогруппы, N-гидроксисукцинимидной эфирной группы, дисульфидной связи и, конечно же, биотина. Упростим эту огромную структуру, заменив биотин на букву «В».
Сульфогруппа в этой структуре придает сильный заряд, который делает эту форму биотиновой мембраны непроницаемой. Мечение белков клеточной поверхности осуществляется путем добавления сульфо-NHS-SS-биотина в клетки, поддерживаемые при температуре, ограничивающей эндоцитоз. Группа NHS реагирует с первичными аминами на поверхностных белках, образуя ковалентные связи.
Затем меченые клетки перемещаются до температуры, позволяющей эндоцитозу, во время которой некоторые из меченых белков будут интернализованы. Наконец, клетки возвращаются к ограничительной температуре, чтобы остановить эндоцитоз. Для того, чтобы конкретно количественно определить интернализованные белки, добавляют гидрофильный, непроницаемый для мембраны восстановитель, такой как L-глутатион. Это вступает в реакцию с дисульфидными связями на неэндоцитозированном сульфо-NHS-SS биотине и расщепляет биотиновые группы. На этом этапе оставшимися биотинилированными белками являются те, метки которых были защищены от восстановителя, поскольку они были ранее интернализованы.
Затем клетки лизируют, и эндоцитозированные биотинилированные белки выделяют для количественного определения. Выделение обычно выполняется путем добавления клеточных лизатов к синтетическим гранулам, покрытым стрептавидином. Поскольку стрептавидин обладает чрезвычайно высоким сродством к биотину, биотинилированные белки прикрепляются к покрытым им гранулам. Серия этапов промывки для удаления загрязняющих белков и, наконец, стадия элюирования для высвобождения связанных белков. Затем целевые белки могут быть проанализированы с помощью таких методов, как вестерн-блоттинг.
Поскольку теперь вы знакомы с концепциями, стоящими за анализом биотинилирования, давайте рассмотрим обобщенный протокол, показывающий, как выполнять эту процедуру для измерения эндоцитоза поверхностных белков.
Начните с культивируемых клеток, охлажденных до 4°C. Поместите их на лед, чтобы поддерживать температуру, ограничивающую эндоцитоз. Затем добавляется мембранный непроницаемый реагент сульфо-NHS-SS-биотин, и клетки инкубируются в темноте в течение примерно 30 минут. Это дает достаточно времени для ковалентного прикрепления меток биотина к поверхностным белкам. Затем клетки извлекают изо льда и инкубируют при температуре 37°C в течение примерно 30 минут. При этой температуре происходит эндоцитоз биотинилированных поверхностных белков. После инкубации клетки охлаждают до 4°C и добавляют гидрофильный восстановитель, такой как L-глутатион. Он вступает в реакцию с дисульфидными связями и высвобождает биотиновые группы из меченых, неэндоцитозированных белков.
Затем клетки лизируются центрифугированием, тем самым разрушая клеточные мембраны и подвергая воздействию биотинилированные белки. После этого к гранулам, покрытым стрептавидином, добавляются лизаты и биотинилированные белки вступают в связь. Шарики промываются холодным фосфатным буфером и элюируются буфером, содержащим моющие и восстановительные вещества. Эти реагенты денатурируют связанные белки с гранул и способствуют их восстановлению в элюате. Белки в элюате разделяются на основе их молекулярной массы с помощью гель-электрофореза. Наконец, вестерн-блоттинг и зондирование блоттинга белок-специфическими антителами позволяют визуализировать целевой белок. Процент эндоцитозированного белка может быть количественно определен на основе результирующей плотности полосы.
Теперь, когда вы понимаете методологию биотинилирования клеток, давайте посмотрим, как она используется в конкретных экспериментах.
Наиболее распространенным применением этого протокола биотинилирования является измерение эндоцитарной скорости специфических белков клеточной поверхности. Здесь ученых заинтересовала оценка интернализации транспортера дофамина или DAT. Следуя стандартному протоколу, ученые смогли измерить процент эндоцитозированных DAT. Это репрезентативный иммуноблоттинг, показывающий полосу T, соответствующую «общему» количеству белка до интернализации, полоса S предназначена для «очищенных» образцов, в которых клеткам никогда не позволяли пройти через эндоцитоз, а обрабатывали восстановителем, а полоса I представляет результаты «интернализованных» белков.
В дополнение к измерению эндоцитоза поверхностных белков, ученые также изучают влияние лекарств на этот процесс. В этом исследовании ученые оценивали поверхностную плотность DAT в ответ на обработку активатором протеинкиназы C (PKC), действие которого, как предполагается, индуцирует интернализацию DAT. Ученые подтвердили это, адаптировав протокол биотинилирования in vitro для использования в анализе ex vivo на тканях мозга мышей. Данные показали потерю примерно 30% DAT из клеточной мембраны в ответ на активацию PKC.
Наконец, настроив анализ биотинилирования, ученые также могут измерить рециркуляцию мембранных белков. Здесь исследователи изучали белок поверхностного канала, CFTR, ответственный за проведение ионов хлора. Чтобы оценить рециркуляцию, исследователи выполнили стандартный протокол биотинилирования в одной группе клеток и модифицировали протокол для второй группы клеток, добавив шаги после отщепления биотина от неэндоцитозированных поверхностных белков. Эти дополнительные шаги включали повышение температуры до 37°C, чтобы обеспечить рециркуляцию некоторых интернализованных, меченных биотином рецепторных белков. Рассчитав разницу между интернализованными белками до и после рециркуляции, эти ученые смогли количественно оценить процент CFTR, возвращенного обратно в мембрану.
Вы только что посмотрели введение JoVE в анализ биотинилирования клеточной поверхности. В видео описывались процедурные этапы этого анализа и объяснялась реакция, происходящая на каждом этапе. Наконец, мы рассмотрели несколько примеров экспериментов, которые продемонстрировали применимость этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!
Q1: What is biotin and why is it used in cell-surface labeling experiments?
Biotin, also known as vitamin H, is a small, water-soluble molecule ideal for labeling cell surface proteins. The sulfo-NHS-SS-biotin derivative used in these assays contains a sulfo group that imparts strong charge, making it membrane impermeant so it labels only surface proteins. This allows scientists to track protein internalization without the label entering the cell prematurely.
Q2: How does temperature control regulate the biotinylation assay protocol?
The assay uses temperature shifts to control endocytosis timing. Cells are maintained at 4°C, a restrictive temperature preventing endocytosis, during initial biotin labeling. They are then moved to 37°C, a permissive temperature allowing endocytosis of labeled proteins. Finally, cells return to 4°C to halt endocytosis, ensuring precise measurement of internalized proteins during the defined window.
Q3: What role does L-glutathione play in distinguishing internalized from surface proteins?
L-glutathione is a hydrophilic, membrane-impermeant reducing agent that cleaves disulfide bonds on the biotin label. It removes biotin from unendocytosed surface proteins but cannot penetrate the cell membrane to reach internalized proteins. This selective cleavage leaves only biotinylated proteins that were protected inside the cell, enabling quantification of internalized proteins.
Q4: How are biotinylated proteins isolated and identified in the cell-surface biotinylation assay?
After cell lysis, biotinylated proteins are isolated using streptavidin-coated beads, which bind biotin with extremely high affinity. Following washing steps to remove contaminants, proteins are eluted using detergents and reducing agents. The recovered proteins are then separated by gel electrophoresis and analyzed using Western blotting with protein-specific antibodies for visualization and quantification.
Q5: What can scientists learn by measuring dopamine transporter endocytosis using biotinylation?
By applying the cell-surface biotinylation assay to dopamine transporter (DAT), scientists can quantify the percentage of DAT proteins internalized from the cell membrane. This measurement reveals how cells regulate neurotransmitter transporter availability and can show how drugs like protein kinase C activators affect transporter internalization, providing insights into cellular signaling and drug responses.
Q6: How can the biotinylation assay be modified to measure protein recycling?
To measure recycling, researchers perform the standard biotinylation protocol, then add steps after cleaving biotin from unendocytosed surface proteins. They raise temperature back to 37°C to allow internalized, biotin-tagged proteins to recycle back to the membrane. By comparing internalized protein amounts before and after recycling, scientists quantify the percentage of proteins recycled, as demonstrated with CFTR channel protein studies.
Q7: Why is the cell-surface biotinylation assay important for studying endocytosis and exocytosis pathways?
The biotinylation assay directly measures how cells regulate surface protein density through an introduction to endocytosis and exocytosis mechanisms. By tracking labeled proteins through internalization, degradation, and recycling pathways, scientists can quantify the spatiotemporal distribution of membrane proteins and understand how cells respond to extracellular signals and regulate cellular transport processes.