Обнаружение спирохета Лайма, Borrelia Burgdorferi, в тактах, используя вложенные PCR

Болезнь Лайма — это изнурительное заболевание, вызываемое спирохетальным патогеном Borrelia burgdorferi sensu lato. Бактерия передается человеку через укус инфицированного клеща и вызывает мультисистемные симптомы, которые могут поражать кожу, суставы, сердце и нервную систему. Повседневные действия, такие как выгул собак и пешие прогулки, могут подвергать людей повышенному риску заражения болезнью Лайма.

Поэтому стратегии борьбы с этой растущей угрозой включают в себя надежные меры эпиднадзора, которые могут выявить распространенность патогена среди клещей и географические регионы, вызывающие обеспокоенность. В этом видео демонстрируется полезность вложенной полимерной цепной реакции в качестве инструмента молекулярного скрининга боррелий. В частности, гены белка А на внешней поверхности и флагеллина В являются мишенью для амплификации.

Рабочий процесс начинается со сбора клещей, экстракции ДНК, а затем первого раунда ПЦР для выявления локусов, специфичных для боррелий. В ПЦР второго раунда продукт первой реакции используется в качестве нового шаблона для получения более мелких фрагментов внутренней амплификации. Клещ считается положительным на возбудителя, когда внутренние ампликоны из обоих генов Borrelia могут быть обнаружены с помощью электрофореза в агарозном геле.

Пассивное наблюдение предполагает помощь граждан и ветеринарных врачей для сбора и сдачи клещей на тестирование. В рамках этого процесса важно собрать такую информацию, как хозяин клеща, дата и место встречи. В лабораторных условиях клещи должны быть сначала сфотографированы и идентифицированы на основе морфологического сравнения со стандартными ключами.

Чувствительность вложенной ПЦР делает этот метод уязвимым к загрязнению, поэтому каждый этап обработки образца должен происходить в отдельном, чистом месте, а также должен быть включен множественный контроль, чтобы гарантировать, что реагенты и окружающая среда не содержат загрязняющих веществ. После того, как рабочее место будет соответствующим образом подготовлено, разделите клеща пополам в стерилизованном шкафу биологической безопасности и поместите половину в микроцентрифужную пробирку. Можно использовать любую процедуру выделения ДНК, которая дает ПЦР-совместимый шаблон.

В этом видео демонстрируется простая экстракция ДНК на основе хелирования. Для начала добавьте соответствующий объем литического хелатного буфера в зависимости от размера фрагмента клеща и гомогенизируйте с помощью пестика с микротрубкой. Инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия в течение 45 минут в вихревом состоянии, а затем центрифугируйте содержимое.

Пока ждете, подготовьте свежие микроцентрифужные пробирки для каждого образца, аликвотировав 50 микрометров изопропанола. Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку, перемешайте методом инверсии и повторно центрифугируйте, как и раньше. На этот раз выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу ДНК 70% этанолом.

Удалите остатки жидкости с помощью пипетки и высушите гранулу на воздухе в течение 15 минут при комнатной температуре. Наконец, добавьте 50 микрометров 1-миллимолярного триса в каждую гранулу и инкубируйте в течение одного часа на водяной бане при температуре 60 градусов, чтобы ресуспендировать ДНК. Образцы теперь могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия для будущих молекулярных анализов.

Начните со стерилизации шкафа для ПЦР с помощью ультрафиолетового излучения и 70% этанола. Реакционный коктейль состоит из мастер-смеси, содержащей полимеразу, воду, прямые и обратные внешние праймеры, а также ДНК, экстрагированную в ходе предыдущей процедуры. Отдельные реакции настроены на независимое обнаружение OspA и FlaB в каждом образце клеща.

Импульсная центрифугирование образцов, помещение их в термоамплификатор и программирование машины. В первоначальном эксперименте ПЦР используются генспецифические внешние праймеры, которые производят длинные ампликоны. Продукты ПЦР из первой реакции затем становятся шаблоном для последующей амплификации.

В этой вложенной ПЦР используются геноспецифические праймеры, которые отжигаются в пределах первого ампликона для получения новых, более коротких фрагментов ДНК. Продукт второй реакции теперь можно загрузить рядом с эталонной лестницей молекулярной массы на 1,2%-ный агарозный гель и подвергнуть электрофорезу в течение одного часа. Наконец, рассмотрите гель с помощью трансиллюминатора.

В этом примере каждая полоса представляет собой отдельный образец тиков, проанализированный на наличие OspA и FlaB. Ампликоны присутствуют только на некоторых полосах. Несмотря на то, что эти два образца генерировали продукты ПЦР для OspA, только один из них захватывал FlaB.

Образец должен производить полосы, чтобы оба гена считались положительными. Таким образом, визуальный осмотр ПЦР-продуктов позволяет определить статус боррелии каждого клеща. В целом, вложенная ПЦР является чувствительным, специфичным и относительно простым методом, который может быть применен для наблюдения за боррелиями.

Данные, полученные в результате таких инициатив, могут помочь определить регионы, вызывающие географическую озабоченность по болезни Лайма, и оценить распространенность этого патогена в природе.