FM-красители при переработке везикул
FM-красители — это класс флуоресцентных молекул, которые нашли важное применение в изучении процесса переработки везикул. Благодаря своей химической с…
FM-красители — это мембранные красители, которые широко используются для визуализации переработки везикул. Это процесс, с помощью которого клетка образует везикулы из собственной мембраны для сохранения размера клетки, повторного использования дорогостоящих белков и последовательной транспортировки молекул во внеклеточное пространство. Этот процесс чаще всего изучается в нейронных синапсах, где он участвует в высвобождении нейротрансмиттеров. В дополнение к изучению переработки везикул, FM-красители используются для изучения нескольких других явлений, таких как секреция в хромаффинных клетках и восстановление клеточных мембран после травмы.
В этом видео речь пойдет об использовании FM-красителей в эксперименте по изучению переработки везикул. Мы рассмотрим пошаговый протокол, в котором используются FM-красители для количественной оценки процесса переработки в стимулированных нейронах. Наконец, мы рассмотрим несколько примеров экспериментов, в которых эта уникальная молекула используется различными способами.
Прежде чем приступить к процедуре, давайте сначала рассмотрим биохимические свойства FM-красителей, которые помогут нам понять их функцию в экспериментах по переработке везикул.
Структурно FM-красители представляют собой молекулы стирила, получившие свое название от ученого, который их синтезировал — Фэй Мао. Эти красители имеют три основные структурные особенности: голова, хвост и переносица. Мост состоит из двух ароматических колец с переменной областью двойной связи между ними. Весь этот участок создает флуорофор.
Природа любого флуорофора такова, что при попадании входящего света на определенной длине волны возбуждения его атомы поглощают эту энергию и переводят электроны в возбужденное состояние. Эти электроны возвращаются в основное состояние, излучая энергию вибрационно, и, наконец, в виде света с длиной волны излучения. Гидрофобный хвост позволяет молекуле FM разделяться на липидные бислои клеточной мембраны, а его гидрофильная головка имеет заряд, который ограничивает его локализацию до наружного листка мембраны.
Таким образом, единственный способ, которым он может попасть в клетку, — это эндоцитоз. FM-красители остро чувствительны к окружающей среде и демонстрируют слабую флуоресценцию в полярных растворителях, но сильную флуоресценцию в гидрофобных средах, таких как мембраны. Это создает высококонтрастную мембранную маркировку, которую можно визуализировать и количественно оценить с помощью флуоресцентного микроскопа.
Эти свойства делают FM-красители особенно подходящими для оценки переработки везикул в синапсах. Вкратце, процесс включает в себя инкубацию культур с FM-красителем. Некоторые молекулы FM прикрепляются к мембранам, что значительно увеличивает интенсивность их флуоресценции. Затем стимул инициирует процесс интернализации мембраны. Таким образом, некоторые молекулы FM задерживаются в мембране везикулы, а остальные внешние локализованные молекулы красителя смываются.
При повторной стимуляции интернализованные окрашенные везикулы сливаются с клеточной мембраной, высвобождая свое содержимое, и краситель быстро отделяется, что приводит к быстрому снижению интенсивности флуоресценции. Это задержание может быть количественно определено с помощью флуоресцентного микроскопа.
Теперь, когда вы знакомы с биохимическими принципами FM-красителей, давайте рассмотрим процедуру проведения эксперимента по изучению переработки синаптических везикул с использованием этих красителей.
Чистые, здоровые образцы культур нейронов на покровных листах подготавливают заранее. Эти клетки перемещаются в раствор FM-красителя, в результате чего мембраны мечатся. Затем покровное стекло для образца устанавливается на камеру визуализации микроскопа.
Для проведения операций с жидкостями, таких как промывка, входные и выходные линии жидкости подключаются, образуя герметичную перфузионную камеру. Установите камеру на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Приложите провода к камере и подключите их к электростимулятору. После присоединения фильтры возбуждения и излучения настраиваются в соответствии с используемым FM-красителем.
Загрузка красителя в везикулы посредством эндоцитоза индуцируется с помощью электрической стимуляции. После стимуляции нервные окончания дают восстановиться. Затем внеклеточный краситель смывается буфером; Это также минимизирует фоновую флуоресценцию. Важно поддерживать минимальную интенсивность возбуждения, поскольку FM-красители склонны к фотообесцвечиванию, то есть ослаблению интенсивности флуоресценции из-за длительного возбуждения. После короткой инкубации получаются первые изображения. Далее экзоцитоз индуцируется вторым электрическим сигналом.
После измерения флуоресценции в разные моменты времени после стимуляции, в конце концов, нервные окончания могут быть исчерпывающе стимулированы для выгрузки всего высвобождаемого красителя. Оставшаяся после этого флуоресценция рассматривается как интенсивность фоновой флуоресценции. Затем с помощью инструмента «Область интереса» измеряется собственная флуоресценция каждого изображения в несинаптической области изображения. Фоновая флуоресценция и собственная флуоресценция затем вычитаются из интенсивности флуоресценции каждой временной точки для получения нормализованной интенсивности флуоресценции, которая затем строится в зависимости от времени. Снижение интенсивности с течением времени представляет собой отложение, которое является косвенной мерой переработки везикул.
Теперь, когда мы рассмотрели методологию, давайте рассмотрим, как FM-красители используются в конкретных экспериментах.
Мы обсудили протокол с использованием FM-красителей в стимулированных нейронах. Здесь ученых заинтересовало изучение спонтанной переработки везикул. Они сделали это, используя установленный протокол в сочетании с системой визуализации, достаточно чувствительной, чтобы обнаруживать небольшие изменения интенсивности флуоресценции. Результаты свидетельствуют о снижении интенсивности флуоресценции, которое напрямую связано со спонтанным высвобождением синапсов.
В пресинаптическом нейроне везикулы разделены на два пула: резервный пул или RP и легко высвобождаемый пул или RRP. Здесь ученые использовали FM-красители для анализа доли каждого типа в популяции везикул. Путем последовательного применения электрических стимулов возрастающей интенсивности, эти ученые смогли количественно оценить относительные проценты каждого типа бассейна везикул.
Наконец, клеточные биологи также используют FM-красители для анализа факторов, участвующих в экзоцитарной репарации поврежденных плазматических мембран. В этом эксперименте исследователи были особенно сосредоточены на роли сфингомиелиназы, липид-модифицирующего фермента, в процессе повторного герметизации мембраны. Во-первых, они генерировали клетки с дефицитом фермента сфингомиелиназы с помощью сайленсингирующей обработки РНК. Затем они обработали эти клетки и контрольную группу экзогенным FM-красителем и токсином, который вызывает повреждения плазматической мембраны. Наконец, они рассмотрели все образцы с помощью конфокального микроскопа. Результаты показали, что клетки с дефицитом сфингомиелиназы демонстрируют устойчивое накопление внутриклеточных молекул FM. С другой стороны, контрольные клетки показали минимальный приток FM, что указывает на роль сфингомиелиназы в восстановлении плазматических мембран.
Вы только что посмотрели видео JoVE о FM-красителях при переработке везикул. В видео описывалась биохимия FM-красителей, подробно описывался протокол окрашивания и количественной оценки переработки синаптических везикул, а также описывались текущие эксперименты с использованием этих красителей различными способами. Как всегда, спасибо за просмотр!
FM-красители — это мембранные красители, которые широко используются для визуализации переработки везикул. Это процесс, с помощью которого клетка образует везикулы из собственной мембраны для сохранения размера клетки, повторного использования дорогостоящих белков и последовательной транспортировки молекул во внеклеточное пространство. Этот процесс чаще всего изучается в нейронных синапсах, где он участвует в высвобождении нейротрансмиттеров. В дополнение к изучению переработки везикул, FM-красители используются для изучения нескольких других явлений, таких как секреция в хромаффинных клетках и восстановление клеточных мембран после травмы.
В этом видео речь пойдет об использовании FM-красителей в эксперименте по изучению переработки везикул. Мы рассмотрим пошаговый протокол, в котором используются FM-красители для количественной оценки процесса переработки в стимулированных нейронах. Наконец, мы рассмотрим несколько примеров экспериментов, в которых эта уникальная молекула используется различными способами.
Прежде чем приступить к процедуре, давайте сначала рассмотрим биохимические свойства FM-красителей, которые помогут нам понять их функцию в экспериментах по переработке везикул.
Структурно FM-красители представляют собой молекулы стирила, получившие свое название от ученого, который их синтезировал — Фэй Мао. Эти красители имеют три основные структурные особенности: голова, хвост и переносица. Мост состоит из двух ароматических колец с переменной областью двойной связи между ними. Весь этот участок создает флуорофор.
Природа любого флуорофора такова, что при попадании входящего света на определенной длине волны возбуждения его атомы поглощают эту энергию и переводят электроны в возбужденное состояние. Эти электроны возвращаются в основное состояние, излучая энергию вибрационно, и, наконец, в виде света с длиной волны излучения. Гидрофобный хвост позволяет молекуле FM разделяться на липидные бислои клеточной мембраны, а его гидрофильная головка имеет заряд, который ограничивает его локализацию до наружного листка мембраны.
Таким образом, единственный способ, которым он может попасть в клетку, — это эндоцитоз. FM-красители остро чувствительны к окружающей среде и демонстрируют слабую флуоресценцию в полярных растворителях, но сильную флуоресценцию в гидрофобных средах, таких как мембраны. Это создает высококонтрастную мембранную маркировку, которую можно визуализировать и количественно оценить с помощью флуоресцентного микроскопа.
Эти свойства делают FM-красители особенно подходящими для оценки переработки везикул в синапсах. Вкратце, процесс включает в себя инкубацию культур с FM-красителем. Некоторые молекулы FM прикрепляются к мембранам, что значительно увеличивает интенсивность их флуоресценции. Затем стимул инициирует процесс интернализации мембраны. Таким образом, некоторые молекулы FM задерживаются в мембране везикулы, а остальные внешние локализованные молекулы красителя смываются.
При повторной стимуляции интернализованные окрашенные везикулы сливаются с клеточной мембраной, высвобождая свое содержимое, и краситель быстро отделяется, что приводит к быстрому снижению интенсивности флуоресценции. Это задержание может быть количественно определено с помощью флуоресцентного микроскопа.
Теперь, когда вы знакомы с биохимическими принципами FM-красителей, давайте рассмотрим процедуру проведения эксперимента по изучению переработки синаптических везикул с использованием этих красителей.
Чистые, здоровые образцы культур нейронов на покровных листах подготавливают заранее. Эти клетки перемещаются в раствор FM-красителя, в результате чего мембраны мечатся. Затем покровное стекло для образца устанавливается на камеру визуализации микроскопа.
Для проведения операций с жидкостями, таких как промывка, входные и выходные линии жидкости подключаются, образуя герметичную перфузионную камеру. Установите камеру на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Приложите провода к камере и подключите их к электростимулятору. После присоединения фильтры возбуждения и излучения настраиваются в соответствии с используемым FM-красителем.
Загрузка красителя в везикулы посредством эндоцитоза индуцируется с помощью электрической стимуляции. После стимуляции нервные окончания дают восстановиться. Затем внеклеточный краситель смывается буфером; Это также минимизирует фоновую флуоресценцию. Важно поддерживать минимальную интенсивность возбуждения, поскольку FM-красители склонны к фотообесцвечиванию, то есть ослаблению интенсивности флуоресценции из-за длительного возбуждения. После короткой инкубации получаются первые изображения. Далее экзоцитоз индуцируется вторым электрическим сигналом.
После измерения флуоресценции в разные моменты времени после стимуляции, в конце концов, нервные окончания могут быть исчерпывающе стимулированы для выгрузки всего высвобождаемого красителя. Оставшаяся после этого флуоресценция рассматривается как интенсивность фоновой флуоресценции. Затем с помощью инструмента «Область интереса» измеряется собственная флуоресценция каждого изображения в несинаптической области изображения. Фоновая флуоресценция и собственная флуоресценция затем вычитаются из интенсивности флуоресценции каждой временной точки для получения нормализованной интенсивности флуоресценции, которая затем строится в зависимости от времени. Снижение интенсивности с течением времени представляет собой отложение, которое является косвенной мерой переработки везикул.
Теперь, когда мы рассмотрели методологию, давайте рассмотрим, как FM-красители используются в конкретных экспериментах.
Мы обсудили протокол с использованием FM-красителей в стимулированных нейронах. Здесь ученых заинтересовало изучение спонтанной переработки везикул. Они сделали это, используя установленный протокол в сочетании с системой визуализации, достаточно чувствительной, чтобы обнаруживать небольшие изменения интенсивности флуоресценции. Результаты свидетельствуют о снижении интенсивности флуоресценции, которое напрямую связано со спонтанным высвобождением синапсов.
В пресинаптическом нейроне везикулы разделены на два пула: резервный пул или RP и легко высвобождаемый пул или RRP. Здесь ученые использовали FM-красители для анализа доли каждого типа в популяции везикул. Путем последовательного применения электрических стимулов возрастающей интенсивности, эти ученые смогли количественно оценить относительные проценты каждого типа бассейна везикул.
Наконец, клеточные биологи также используют FM-красители для анализа факторов, участвующих в экзоцитарной репарации поврежденных плазматических мембран. В этом эксперименте исследователи были особенно сосредоточены на роли сфингомиелиназы, липид-модифицирующего фермента, в процессе повторного герметизации мембраны. Во-первых, они генерировали клетки с дефицитом фермента сфингомиелиназы с помощью сайленсингирующей обработки РНК. Затем они обработали эти клетки и контрольную группу экзогенным FM-красителем и токсином, который вызывает повреждения плазматической мембраны. Наконец, они рассмотрели все образцы с помощью конфокального микроскопа. Результаты показали, что клетки с дефицитом сфингомиелиназы демонстрируют устойчивое накопление внутриклеточных молекул FM. С другой стороны, контрольные клетки показали минимальный приток FM, что указывает на роль сфингомиелиназы в восстановлении плазматических мембран.
Вы только что посмотрели видео JoVE о FM-красителях при переработке везикул. В видео описывалась биохимия FM-красителей, подробно описывался протокол окрашивания и количественной оценки переработки синаптических везикул, а также описывались текущие эксперименты с использованием этих красителей различными способами. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are FM dyes and how do they work in membrane imaging?
FM dyes are styryl fluorescent molecules that insert into the outer leaflet of cell membranes. They fluoresce strongly in hydrophobic environments like lipid bilayers but weakly in polar solvents, creating high-contrast membrane labeling. When struck by excitation light, their electrons enter an excited state and emit light at a specific wavelength, enabling visualization under a fluorescence microscope.
Q2: Why can FM dyes only enter cells through endocytosis?
FM dyes have a hydrophilic, charged head group that restricts their localization to the outer membrane leaflet. This charge prevents the molecule from crossing the lipid bilayer directly. The only way FM dyes can reach the cell interior is via endocytosis and exocytosis, the processes by which cells internalize and recycle membrane vesicles containing the dye molecules.
Q3: How does FM dye fluorescence change during vesicle recycling?
During vesicle recycling, FM dye fluorescence increases when dye-labeled membranes are internalized into vesicles, trapping the dye in the hydrophobic environment. Upon exocytosis, vesicles fuse with the cell membrane and the dye rapidly departitions into the extracellular space, causing a sharp decrease in fluorescence intensity that can be quantified to measure recycling rates.
Q4: What is photobleaching and why is it a concern in FM dye experiments?
Photobleaching is the weakening of fluorescence intensity caused by prolonged exposure to excitation light. FM dyes are particularly prone to photobleaching, so researchers minimize excitation intensity during imaging to preserve signal. This precaution ensures accurate quantification of destaining and prevents loss of fluorescence data before measurements are complete.
Q5: How are vesicle pools distinguished using FM dyes in neurons?
Scientists apply sequential electrical stimuli of increasing intensities to neurons labeled with FM dyes. This approach allows them to quantify the relative percentages of the reserve pool and readily releasable pool of synaptic vesicles. The differential destaining patterns reveal how many vesicles are available for immediate release versus those held in reserve.
Q6: What does normalized fluorescence intensity reveal about vesicle recycling?
Normalized fluorescence intensity is calculated by subtracting background and intrinsic fluorescence from raw intensity measurements at each time point. When plotted over time, the decrease in normalized intensity represents destaining, which serves as an indirect measure of vesicle recycling. This quantification allows researchers to assess the rate and extent of membrane internalization and recycling.
Q7: How do FM dyes help identify the role of sphingomyelinase in membrane repair?
Researchers compared FM dye uptake in sphingomyelinase-deficient cells versus control cells after inducing plasma membrane lesions. Sphingomyelinase-deficient cells showed robust intracellular FM accumulation, while controls showed minimal influx. This difference demonstrated that sphingomyelinase plays a critical role in the exocytic repair process that normally seals membrane wounds.