4.9: FM-красители при переработке везикул

FM-красители — это мембранные красители, которые широко используются для визуализации переработки везикул. Это процесс, с помощью которого клетка образует везикулы из собственной мембраны для сохранения размера клетки, повторного использования дорогостоящих белков и последовательной транспортировки молекул во внеклеточное пространство. Этот процесс чаще всего изучается в нейронных синапсах, где он участвует в высвобождении нейротрансмиттеров. В дополнение к изучению переработки везикул, FM-красители используются для изучения нескольких других явлений, таких как секреция в хромаффинных клетках и восстановление клеточных мембран после травмы.

В этом видео речь пойдет об использовании FM-красителей в эксперименте по изучению переработки везикул. Мы рассмотрим пошаговый протокол, в котором используются FM-красители для количественной оценки процесса переработки в стимулированных нейронах. Наконец, мы рассмотрим несколько примеров экспериментов, в которых эта уникальная молекула используется различными способами.

Прежде чем приступить к процедуре, давайте сначала рассмотрим биохимические свойства FM-красителей, которые помогут нам понять их функцию в экспериментах по переработке везикул.

Структурно FM-красители представляют собой молекулы стирила, получившие свое название от ученого, который их синтезировал — Фэй Мао. Эти красители имеют три основные структурные особенности: голова, хвост и переносица. Мост состоит из двух ароматических колец с переменной областью двойной связи между ними. Весь этот участок создает флуорофор.

Природа любого флуорофора такова, что при попадании входящего света на определенной длине волны возбуждения его атомы поглощают эту энергию и переводят электроны в возбужденное состояние. Эти электроны возвращаются в основное состояние, излучая энергию вибрационно, и, наконец, в виде света с длиной волны излучения. Гидрофобный хвост позволяет молекуле FM разделяться на липидные бислои клеточной мембраны, а его гидрофильная головка имеет заряд, который ограничивает его локализацию до наружного листка мембраны.

Таким образом, единственный способ, которым он может попасть в клетку, — это эндоцитоз. FM-красители остро чувствительны к окружающей среде и демонстрируют слабую флуоресценцию в полярных растворителях, но сильную флуоресценцию в гидрофобных средах, таких как мембраны. Это создает высококонтрастную мембранную маркировку, которую можно визуализировать и количественно оценить с помощью флуоресцентного микроскопа.

Эти свойства делают FM-красители особенно подходящими для оценки переработки везикул в синапсах. Вкратце, процесс включает в себя инкубацию культур с FM-красителем. Некоторые молекулы FM прикрепляются к мембранам, что значительно увеличивает интенсивность их флуоресценции. Затем стимул инициирует процесс интернализации мембраны. Таким образом, некоторые молекулы FM задерживаются в мембране везикулы, а остальные внешние локализованные молекулы красителя смываются.

При повторной стимуляции интернализованные окрашенные везикулы сливаются с клеточной мембраной, высвобождая свое содержимое, и краситель быстро отделяется, что приводит к быстрому снижению интенсивности флуоресценции. Это задержание может быть количественно определено с помощью флуоресцентного микроскопа.

Теперь, когда вы знакомы с биохимическими принципами FM-красителей, давайте рассмотрим процедуру проведения эксперимента по изучению переработки синаптических везикул с использованием этих красителей.

Чистые, здоровые образцы культур нейронов на покровных листах подготавливают заранее. Эти клетки перемещаются в раствор FM-красителя, в результате чего мембраны мечатся. Затем покровное стекло для образца устанавливается на камеру визуализации микроскопа.

Для проведения операций с жидкостями, таких как промывка, входные и выходные линии жидкости подключаются, образуя герметичную перфузионную камеру. Установите камеру на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Приложите провода к камере и подключите их к электростимулятору. После присоединения фильтры возбуждения и излучения настраиваются в соответствии с используемым FM-красителем.

Загрузка красителя в везикулы посредством эндоцитоза индуцируется с помощью электрической стимуляции. После стимуляции нервные окончания дают восстановиться. Затем внеклеточный краситель смывается буфером; Это также минимизирует фоновую флуоресценцию. Важно поддерживать минимальную интенсивность возбуждения, поскольку FM-красители склонны к фотообесцвечиванию, то есть ослаблению интенсивности флуоресценции из-за длительного возбуждения. После короткой инкубации получаются первые изображения. Далее экзоцитоз индуцируется вторым электрическим сигналом.

После измерения флуоресценции в разные моменты времени после стимуляции, в конце концов, нервные окончания могут быть исчерпывающе стимулированы для выгрузки всего высвобождаемого красителя. Оставшаяся после этого флуоресценция рассматривается как интенсивность фоновой флуоресценции. Затем с помощью инструмента «Область интереса» измеряется собственная флуоресценция каждого изображения в несинаптической области изображения. Фоновая флуоресценция и собственная флуоресценция затем вычитаются из интенсивности флуоресценции каждой временной точки для получения нормализованной интенсивности флуоресценции, которая затем строится в зависимости от времени. Снижение интенсивности с течением времени представляет собой отложение, которое является косвенной мерой переработки везикул.

Теперь, когда мы рассмотрели методологию, давайте рассмотрим, как FM-красители используются в конкретных экспериментах.

Мы обсудили протокол с использованием FM-красителей в стимулированных нейронах. Здесь ученых заинтересовало изучение спонтанной переработки везикул. Они сделали это, используя установленный протокол в сочетании с системой визуализации, достаточно чувствительной, чтобы обнаруживать небольшие изменения интенсивности флуоресценции. Результаты свидетельствуют о снижении интенсивности флуоресценции, которое напрямую связано со спонтанным высвобождением синапсов.

В пресинаптическом нейроне везикулы разделены на два пула: резервный пул или RP и легко высвобождаемый пул или RRP. Здесь ученые использовали FM-красители для анализа доли каждого типа в популяции везикул. Путем последовательного применения электрических стимулов возрастающей интенсивности, эти ученые смогли количественно оценить относительные проценты каждого типа бассейна везикул.

Наконец, клеточные биологи также используют FM-красители для анализа факторов, участвующих в экзоцитарной репарации поврежденных плазматических мембран. В этом эксперименте исследователи были особенно сосредоточены на роли сфингомиелиназы, липид-модифицирующего фермента, в процессе повторного герметизации мембраны. Во-первых, они генерировали клетки с дефицитом фермента сфингомиелиназы с помощью сайленсингирующей обработки РНК. Затем они обработали эти клетки и контрольную группу экзогенным FM-красителем и токсином, который вызывает повреждения плазматической мембраны. Наконец, они рассмотрели все образцы с помощью конфокального микроскопа. Результаты показали, что клетки с дефицитом сфингомиелиназы демонстрируют устойчивое накопление внутриклеточных молекул FM. С другой стороны, контрольные клетки показали минимальный приток FM, что указывает на роль сфингомиелиназы в восстановлении плазматических мембран.

Вы только что посмотрели видео JoVE о FM-красителях при переработке везикул. В видео описывалась биохимия FM-красителей, подробно описывался протокол окрашивания и количественной оценки переработки синаптических везикул, а также описывались текущие эксперименты с использованием этих красителей различными способами. Как всегда, спасибо за просмотр!