Введение в клеточную смерть

Парадоксально, но смерть клеток помогает формировать жизнь организма. Как и любой организм в целом, клетки могут погибнуть в результате старения, из-за случайной травмы, или после проникновения патогена клетка может пожертвовать собой, чтобы предотвратить распространение инфекции. В этих обстоятельствах клетки могут следовать различными путями смерти, такими как апоптоз, аутофагия или некроз. Все эти типы имеют определенные морфологические характеристики. Апоптоз или запрограммированная гибель клеток приводит к «блеббингу» мембраны и фрагментации ядер. Аутофагия, которая также регулируется, приводит к образованию крупных вакуолей, заключающих в себе клеточные компоненты. Наконец, некроз, который является «незапланированным» или случайным, заканчивается лизисом клеток.

В этом видео мы обсудим важные открытия, которые привели к идентификации этих путей, рассмотрим вопросы, которые исследователи все еще задают о клеточной смерти, обсудим инструменты, которые они используют для ответа на них, и, наконец, рассмотрим несколько примеров экспериментов.

Во-первых, давайте рассмотрим некоторых ключевых исследователей, которые помогли расшифровать различные пути гибели клеток.

Современные термины, используемые для описания этих путей, восходят к Гиппократу, врачу в Древней Греции. Он использовал термин «апоптоз», означающий «отпадение», чтобы описать «измельчение костей», наблюдаемое после перелома. Что касается современной эпохи, то первое заметное упоминание о «некрозе» произошло в 1859 году, когда Рудольф Вирхов в своей компиляции под названием «Клеточная патология» использовал этот термин для описания «прогрессирующего разрушения тканей».С

достижениями в области микроскопии и гистологии в течение следующего десятилетия, в 1877 году Карл Вейгерт и Юлиус Конхейм смогли изучить некроз на клеточном уровне. Они дали представление о морфологических особенностях, связанных с этим типом смерти, таких как потеря ядер.

Почти 70 лет спустя Кристиан де Дюв открыл аутофагию — процесс, при котором клеточные компоненты поглощаются и разрушаются связанными с мембраной органеллами, называемыми аутофагосомами, которые сливаются с другим типом органелл — лизосомами — для дальнейшего разрушения их содержимого. Теперь мы знаем, что аутофагия на самом деле играет двойную роль в клетке, способствуя выживанию или вызывая смерть.

В 1972 году Джон Керр, А. Р. Карри и Эндрю Уайли наблюдали другой тип клеточной смерти со своеобразной морфологией. Поскольку этот процесс включал в себя «отваливание» кусков мертвых клеток, они дали ему древнегреческое название апоптоз. Позже, в 1977 году, когда Х. Р. Хорвиц и Джон Салстон изучали развитие C. elegans, апоптоз был признан формой «запрограммированной клеточной смерти». Они заметили, что у разных червей определенные клетки подвергаются апоптозу одновременно.

Поскольку это происходило на ранних стадиях развития, это намекало на то, что гены могут управлять апоптозом. Эта гипотеза была подтверждена группой Хорвица в 1980-х годах, когда они заметили, что клетки с мутациями в определенных генах ced или «смерти C. elegans» не умирали во время развития этих червей. Позже Хорвиц показал, что ген ced-3 кодирует фермент, разрушающий белки, называемый каспазой. Теперь мы знаем, что существует несколько каспаз, и они играют важную роль в гибели клеток.

Эти достижения в области клеточной смерти открыли новые пути для исследователей. Давайте рассмотрим некоторые из них.

Всегда существовал интерес к выяснению того, какие факторы вызывают гибель клеток. Чтобы идентифицировать их, исследователи в настоящее время подвергают клетки воздействию радиации, химических веществ и сигнальных молекул, а затем ищут изменения в степени или типе смерти.

Другие ученые заинтересованы в выяснении биохимических путей, участвующих в каждом механизме клеточной смерти. В настоящее время мы знаем, что апоптоз следует по пути, где каспазы являются ключевыми ферментами, в то время как аутофагия включает в себя белки, которые необходимы для образования аутофагосом. Тем не менее, в этих путях есть компоненты, которые неизвестны, и исследователи пытаются найти способы их объяснить. Кроме того, исследователи также изучают, возникают ли какие-либо «перекрестные помехи» между путями клеточной смерти. Если присутствуют перекрестные помехи, то тот же сигнал может влиять на апоптоз, а также аутофагию.

Наконец, популярная область исследований связана с пониманием того, почему определенные клетки, такие как раковые клетки, становятся бессмертными. Ученые постоянно ищут мутации в раковых клетках и оценивают, влияют ли какие-либо из них на гены, кодирующие факторы, участвующие в путях смерти.

Все это сложные вопросы, но, к счастью, в распоряжении исследователей есть множество инструментов, чтобы ответить на них.

Анализ трипанового синего является широко используемым инструментом скрининга для оценки влияния соединения на гибель клеток. Анализ основан на окрашивании, которое не может проникнуть в живые клетки, так как они обладают «селективными мембранами», но может легко проникнуть в мертвые клетки, поскольку их мембраны «разрываются».

Поэтому ученые разработали такие методы, как анализ активности каспаз. Поскольку каспазы активируются во время апоптоза, ученые могут добавлять субстраты для этих ферментов, которые флуоресцируют при активации каспазами. Это помогает в идентификации апоптотических клеток.

Точно так же фрагментация ДНК, происходящая во время апоптоза, может быть легко идентифицирована с помощью анализа TUNEL, который основан на реагентах, помечающих «зазубренные» концы поврежденной ДНК. Поскольку этот метод относительно прост в применении, он широко используется в полевых условиях.

Когда ученые хотят определить механизм гибели клеток, происходящий в их популяции, они могут сопоставить красители аннексина V и йодида пропидия (PI) с анализом проточной цитометрии. Аннексин V связывается с остатками фосфатидилсерина в мембране, в то время как PI проникает через поврежденные мембраны и связывается с ДНК. Изучая полученные данные, ученые могут разделять клетки, претерпевающие различные пути гибели.

Наконец, ученые могут использовать визуализацию живых клеток для наблюдения за процессом гибели клеток в режиме реального времени. Это всеобъемлющий метод, который может быть использован для идентификации аутофагических, некротических или апоптотических клеток на основе уникальных морфологических особенностей.

Как вы уже видели, существует несколько методов обнаружения гибели клеток, некоторые из которых не специфичны, другие могут помочь идентифицировать апоптотические клетки, а некоторые различают различные пути.

Теперь давайте посмотрим, как ученые используют эти методы для изучения смерти клеток.

Диета играет важную роль в здоровье и может влиять на гибель клеток в различных тканях. В этом анализе in vitro исследователи подвергли нейроны мыши воздействию пальмитиновой кислоты, насыщенной жирной кислоты, присутствующей как в молочных продуктах, так и в мясе, а затем использовали анализ каспазы для оценки апоптоза. Они обнаружили, что клетки, обработанные пальмитиновой кислотой, демонстрируют повышенную активность каспаз и гибель клеток.

Другие исследователи используют эти анализы, чтобы определить, как лекарства индуцируют различные механизмы смерти. Здесь трансгенным мышам с флуоресцентно мечеными раковыми клетками вводили доксорубицин, противораковый препарат. Затем ученые визуализировали клетки живых животных и, наблюдая за изменениями в морфологии раковых клеток, определили, что медикаментозное лечение вызывает как апоптоз, так и некроз.

Наконец, некоторые ученые изучают, можно ли обратить вспять гибель клеток. В этом эксперименте исследователи подвергли раковые клетки человека воздействию этанола и подтвердили с помощью различных анализов, что это лечение заставило их встать на путь апоптоза. После смывания этанола пораженные клетки смогли восстановиться после апоптоза с помощью процесса, называемого «анастазом». Это дало представление о том, как рак может вернуться после медикаментозного лечения.

Вы только что посмотрели введение JoVE в пути гибели клеток. В этом видео рассматривается богатая история исследований клеточной смерти — с древних времен до 20-го века, — а затем обсуждаются некоторые актуальные вопросы. Мы также объяснили популярные методы анализа клеточной смерти и продемонстрировали, как эти методы используются для лучшего понимания связи между окружающей средой, болезнью и гибелью клеток. Как всегда, спасибо за просмотр!