Субцеллюлярные фракционирование Эрк активации на митохондриальной производные пептид лечение

Общая цель этого эксперимента заключается в выявлении нисходящего сигнального каскада, участвующего в клетках, стимулированных пептидами митохондриального происхождения. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области митохондриальных пептидов, например, какие сигнальные пути задействованы и где это происходит. Основное преимущество этой техники заключается в том, что она проста и относительно проста в выполнении.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы изучали передачу сигналов ERK, опосредованную гуманином, что дало нам ограниченную информацию о последующих фактах. Субмасштабный метод Кершера дал нам лучшее представление о роли передачи сигналов, опосредованной гуманином. На третий день после нанесения покрытия и промывки два раза по десять на шестой, SH-SY5Y или HEK293 ячейки согласно текстовому протоколу.

Растворите пептиды гуманина S14G в отфильтрованной дистиллированной воде с нулем целых двух десятых микрона. И воссоздать их в виде одномиллимолярного стокового раствора. Аквотируйте предварительно подогретую сывороткосодержащую или бессывороточную среду в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте исходный раствор пептида гуманина комнатной температуры до получения рабочей концентрации.

Немедленно замените среду в клетках шестью миллилитрами пептидного раствора. И инкубируйте клетки в течение соответствующего количества времени. Используйте 10 миллилитров ледяного PBS, чтобы дважды промыть клетки.

Затем соскребите клетки с пластины в пяти миллилитрах ледяного PBS. И переложите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте ячейки при температуре 500 G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах ледяного фракционирующего буфера и инкубируйте на льду в течение 15 минут. Центрифугируйте пробирку при температуре 250 G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем соберите надосадочную жидкость в виде цитоплазматической фракции и оставьте гранулу для ядерной фракции.

Центрифугируйте надосадочную жидкость для удаления клеточного мусора и других загрязнений при температуре 18000 G и четырех градусах Цельсия в течение десяти минут. А затем перенести надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку. Это фракция цитизола.

Повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах ледяного буфера для промывки и центрифугируйте раствор при температуре 250 G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и используйте 100 микролитров ледяного ядерного экстракционного буфера для повторного суспендирования гранулы. Затем обработайте образец ультразвуком на льду 10 раз.

Снова центрифугируйте образец. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку. Чтобы изолировать сырую митохондриальную фракцию, используйте 10 миллилитров ледяного PBS для промывания клеток в каждой 10-сантиметровой чашке.

Затем добавьте пять миллилитров ледяного PBS и используйте скребок для клеток, чтобы отделить клетки. Переложите клеточные суспензии в одну коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем центрифугируйте клетки при температуре 600 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Аспирируйте PBS и используйте один миллилитр ледяного митохондриального изоляционного буфера для повторного суспендирования гранулы. Затем с помощью пестика, покрытого политетрафторэтиленом, на льду гомогенизируйте клетки 25 ударами двухмиллилитрового гомогенизатора. Перенесите гомогенат в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте образец при температуре 600 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы удалить ядра и неповрежденные клетки.

Затем соберите надосадочную жидкость, перенесите ее в новую микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте раствор при температуре 7000 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу с 200 микролитрами ледяного изолирующего буфера митохондрий и переложите раствор в новую микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте пробирку при 7000 умноженных на G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

После повторения промывки используйте 15 микролитров буфера RIPA для повторного суспендирования гранул и инкубируйте суспензию на льду в течение 10 минут. Затем центрифугируйте образец при температуре 16000 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Перенесите надосадочную жидкость, которая является митохондриальной фракцией, в новую трубку.

Количественно определите и проведите вестерн-блоттинг согласно текстовому протоколу. С помощью процедуры, продемонстрированной в этом видео, клетки HEK293 и SH-SY5Y отступили с помощью одного и 100 микромолярного гуманина S14 G, мощного аналога гуманина. А также проанализирована общая и фосфорилированная форма ERK12 на теанине 202, тирозине 204 из экстрактов общего белка.

Как видно на рисунке, обработка S14G гуманином показала увеличение фосфорилирования ERK12 и его регуляторного теанина-202, тирозина-204. Для понимания мишени S14G-гуманин-опосредованной активации ERK12 была проанализирована субклеточная локализация общего и фосфорилированного ERK12 после лечения S14G гуманином. Как показано в этих вестерн-блотах, в клетках HEK293 фосфорилированный ERK увеличивался как в цитоплазме, так и в ядре, но не в митохондриях.

Однако в клетках SH-SY5Y фосфорилированный ERK уменьшался в ядре цитоплазмы и митохондриях. Можно предположить, что S14G-гуманин-опосредованное фосфорилирование ERK может играть различную роль в разных типах клеток и в разных условиях. После освоения фракционирование ядра клетки может быть выполнено за один час, а митохондриальное фракционирование может быть выполнено за один час и 30 минут, если оно выполнено правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что все образцы должны быть на льду. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, включая коиммунное осаждение и масс-спектрометрию, чтобы понять следующие мишени сигнальных молекул.