Мечение Аннексином V и йодидом пропидиума

Мечение клеток аннексином V и йодидом пропидия (PI) — это метод, используемый для идентификации клеточной смерти и различения ее различных путей: апоптоза, или запрограммированной гибели клеток, и некроза. Клетки претерпевают различные морфологические изменения в зависимости от пути. Выявляя специфические условия, которые приводят клетку к апоптозу или некрозу, ученые получают представление о клеточной физиологии и патофизиологии заболеваний. Мечение аннексином V и PI с последующей проточной цитометрией было установлено как один из наиболее эффективных методов классификации типа клеточной гибели.

Сегодня мы опишем, как этот анализ помогает в идентификации путей гибели клеток, как использовать эту технику, а также рассмотрим несколько захватывающих примеров экспериментов, в которых этот метод используется для ответа на важные вопросы в области клеточной биологии.

Во-первых, давайте рассмотрим принципы, лежащие в основе окрашивания аннексином V и PI.

Как упоминалось ранее, апоптотические клетки проявляют отличительные морфологические особенности. К ним относятся усадка клеток, блеббинг мембраны, фрагментация ядер и появление апоптотических тел. Кроме того, после индукции апоптоза, т. е. на ранней стадии апоптоза, на мембране появляются некоторые характерные изменения. Нормальная клеточная мембрана содержит все остатки фосфатидилсерина или ФС на внутренней створке. Тем не менее, в ранних апоптотических клетках некоторые из этих остатков PS перемещаются на внешнюю поверхность, но каким образом?

Чтобы понять это, давайте сделаем шаг назад. Хорошо известно, что во время апоптоза активируются цитозольные каспазы. Эти ферменты, в свою очередь, активируют связанный с мембраной фермент, называемый скрамблаза. Скремблаза «скремблирует» клеточную мембрану, перемещая остатки PS с цитоплазматической стороны на внешнюю поверхность. Напротив, при некрозе остатки полистирола остаются там, где они есть, но сама мембрана разрывается. Аннексин V и мечение PI извлекают выгоду из этих различий в изменениях мембран двух типов клеточной смерти.

Аннексин V, конъюгированный с флуоресцентным красителем, таким как изотиоцианат флуоресцеина, широко известный как FITC, является мембранонепроницаемым, природным лигандом для PS, и поэтому легко идентифицирует ранние апоптотические клетки путем связывания с экстернализированным PS. Однако после разрыва мембраны, который происходит во время некроза, а также на более поздних стадиях апоптоза, аннексин также может связываться с PS на внутренней поверхности и давать ложноположительные результаты.

Чтобы этого избежать, ученые используют PI. Эта молекула ДНК-связывающего красителя также является непроницаемой для мембраны и может проникнуть в клетку только при разрыве мембраны. Таким образом, если клетка окрашена только аннексином, она является ранней апоптозией, в то время как клетка, окрашенная как PI, так и аннексином, может быть либо некротической, либо поздней апоптотической.

Теперь, когда вы узнали основные принципы, лежащие в основе этого анализа, давайте рассмотрим процедуру окрашивания и анализа гибели клеток.

Во-первых, клетки собирают и центрифугируют на низкой скорости, чтобы предотвратить любые морфологические нарушения, и ресуспендируют в физиологическом буфере, таком как фосфатно-солевой буфер, также известный как PBS. После еще одной стадии центрифугирования клетки ресуспендируют в связывающем аннексине V буфере, содержащем кальций, который необходим для связывания аннексина с PS. Затем аннексин V, конъюгированный с FITC, добавляют в раствор, который инкубируют при комнатной температуре в темноте, чтобы обеспечить ассоциацию аннексина и PS. На следующем этапе PI непосредственно добавляют в раствор для окрашивания клеток аннексина и инкубируют в темноте. После инкубации клетки промывают в PBS центрифугированием, ресуспендируют в промывном буфере и держат на льду. Теперь они готовы к анализу.

Флуоресцентная активность клеток анализируется с помощью проточной цитометрии, лазерного метода, который захватывает флуоресцентные данные от отдельных клеток, взвешенных в потоке жидкости. После флуоресцентной калибровки с использованием клеток, отдельно окрашенных каждым красителем, получаются данные от двойных окрашенных клеток. Флуоресцентные сигналы от клеточной популяции используются для создания графика, на котором интенсивность FETC, связанная с аннексином, отображается на логарифмической оси X, а PI — на логарифмической оси Y. Клетки, которые являются аннексин-FITC положительными и PI-отрицательными, будут группироваться в нижней правой части графика, представляя ранние апоптотические клетки, а клетки, дважды положительные на аннексин-FITC и PI, будут находиться в верхнем правом углу, представляя поздние апоптотические или некротические клетки. Клетки, которые остаются неокрашенными или незначительно окрашенными как по аннексину, так и по ПИ, являются живыми клетками.

Поскольку теперь вы знаете, почему клеточные биологи полагаются на этот метод для изучения клеточной смерти, почему бы нам не рассмотреть некоторые из его применений.

С помощью этой процедуры ученые могут проследить, какие внутриклеточные белки участвуют в апоптозе. В этом видео исследователи проанализировали влияние цисплатина, противоракового препарата, на нормальные клетки почек, чтобы увидеть, вызывает ли он апоптоз. Один набор клеток трансдуцировали для сверхэкспрессии активной формы фермента протеинкиназы С, или PKC, а другой набор трансдуцировали с нефункциональной формой — доминантной отрицательной PKC. Клетки, экспрессирующие PKC и обработанные цисплатином, со временем подвергались апоптозу, но клетки, экспрессирующие неактивный доминантный негативный PKC, были устойчивы к апоптозу, что указывает на то, что фермент является ключевым игроком в пути апоптоза, индуцированного цисплатином.

Исследователи также используют эти красители для проверки цитотоксического потенциала конкретных Т-клеток. Цитотоксические Т-клетки могут распознавать специфические мембранные белки на своей клетке-мишени и вызывать ее гибель при связывании с ней. Здесь исследователи инкубировали антиген-специфические Т-клетки с опухолевыми клетками-мишенями и аннексином V, а затем наблюдали индукцию апоптоза опухолевых клеток путем вовлечения Т-клеток. Данные проточной цитометрии выявили процент гибели клеток-мишеней в присутствии и отсутствии цитотоксических Т-клеток.

Наконец, ученые используют этот метод для оценки жизнеспособности клеток после доставки генов. В этом случае исследователи хотели оценить выживаемость клеток после нуклеофекции — метода, который использует комбинацию химических веществ и приложенного электрического поля для создания переходных пор в клеточных и ядерных мембранах, тем самым облегчая доставку генов. Используя аннексин V и краситель под названием 7-аминоактиномицин D или 7-AAD, который, подобно PI, связывается с ДНК, они показали, что нуклеофекция вызывает низкую гибель клеток в результате апоптоза или некроза.

Вы только что посмотрели видео JoVE о маркировке annexin V и PI. В этом видео мы кратко обсудили отличительные черты апоптотических и некротических клеток, рассмотрели принципы этого метода, рассмотрели обобщенную процедуру для этой часто используемой техники и рассмотрели некоторые варианты ее применения. Учитывая важность понимания того, как разные клетки умирают в разных условиях, мечение аннексином V и PI служит важным инструментом для клеточных биологов, интересующихся этим явлением. Как всегда, спасибо за просмотр!