Улучшенная протокол для иммунопреципитации Chromatin от мыши скелетных мышц

Общая цель этой процедуры заключается в получении хроматина из скелетных мышц взрослой мыши. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регуляции генов и скелетных мышечных волокон. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет получать хроматин класса ChIP из скелетных мышц мыши.

Физически устойчивая ткань с высоким содержанием структурных белков. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы пытались охарактеризовать молекулярные механизмы, лежащие в основе глюкоартированной мышечной атрофии, которая требует идентификации глюкоартированных рецепторов, ДНК-связывающих сайтов в скелетных мышечных волокнах мышей. Демонстрировать процедуру будет Шилпи Джоши, постдок из нашей лаборатории.

Чтобы начать эту процедуру, восстановите замороженные или только что рассеченные мышцы задних конечностей. Впоследствии измельчите мышцы в двухмиллилитровой пробирке, содержащей один миллилитр ледяного гипотонического буфера до однородного приготовления из мелких кусочков, с помощью тонких ножниц. После этого оставьте трубку встряхивать на настольной мешалке при температуре четыре градуса Цельсия на пять-10 минут.

Затем перенесите рассеченную ткань в 14-миллилитровую трубку с круглым дном, содержащую четыре миллилитра холодного гипотонического буфера. Гомогенизируйте измельченную ткань с помощью механического гомогенизатора в течение 15-30 секунд. После этого переложите гомогенат в 15-миллилитровую трубку.

Добавьте холодный гипотонический буфер в 10 миллилитров образца и закрепите гомогенат, прежде чем приступать к следующей мыши. В этой процедуре добавьте формальдегид в образец, чтобы получить конечную концентрацию 1%. А затем взбалтываем в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем добавьте глицин, чтобы конечная концентрация в каждой пробирке составила 0,125 моляра, чтобы остановить фиксацию. И встряхиваем от пяти до 10 минут при комнатной температуре. После этого гомогенизируйте зафиксированный лизат, используя рыхлый наунс.

Затем переложите его в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте при 1000 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы получить ядра и клеточный мусор. Через пять минут удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах свежего гипотонического буфера. Отфильтруйте лизат через клеточное сетчатое фильтр 70 микрометров в 50-миллилитровую пробирку.

С помощью наконечника для пипетки промойте фильтр одним миллилитром холодного гипотонического буфера. После этого повторно отфильтруйте фильтрат через 40-микрометровый сетчатый фильтр. Впоследствии переложите фильтрат в 15-миллилитровую пробирку.

И центрифугировать при 1000 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы получить ядерную таблетку. После удаления надосадочной жидкости используйте один миллилитр гипотонического буфера, чтобы объединить три гранулы и переложите их в пробирку объемом от 1,5 до двух миллилитров. Центрифугируйте при 1000 г в течение пяти минут.

Затем оценивают объем ядерной таблетки путем сравнения с пробирками, содержащими известный объем жидкости, и повторно суспендируют ее в ультразвуковом буфере в объеме, в три или четыре раза превышающем объем упакованного ядра. Впоследствии обрабатывайте суспензию ультразвуком в течение 10-15 минут при температуре четыре градуса Цельсия, используя ультразвуковую терапию. Центрифугируйте обработанный ультразвуком образец и перенесите надосадочную жидкость хроматина в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Для расшивки возьмите 30 микролитров хроматина в 1,5-миллилитровую пробирку и добавьте 20 микролитров пяти моляров натрия хлорида и 450 микролитров воды. Доведите объем до 500 микролитров и инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день проведите лечение одним микролитром протеиназы К, 10 микролитрами двух молярных трисов при pH 6,8 и 10 микролитрами 0,5 молярной ЭДТА в течение одного часа при 42 градусах Цельсия.

Затем проведите регулярную экстракцию фенол-хлороформа хлороформа и осадите ДНК одним объемом ацетата натрия и двумя объемами 100% этанола в течение одного часа при температуре минус 80 градусов Цельсия или в течение ночи при температуре минус 20 градусов Цельсия. Затем гранулируйте ДНК методом центрифугирования при 13 500 г в течение 15 минут. Сцедите надосадочную жидкость и тщательно промойте гранулу холодным 70%-ным этанолом и снова центрифугируйте в течение пяти минут.

Затем сцедите надосадочную жидкость и высушите гранулу на воздухе. После этого повторно суспендируйте гранулу в исходном объеме трис HCl ЭДТА буфера. Измерьте концентрацию ДНК в спектрофотометре с помощью абсорбентов на 260 нанометрах, 280 нанометрах.

Впоследствии пипетировали от 500 до 1000 нанограммов ДНК вместе с лестницей размером с ДНК на отдельные полосы 1,5%-ного агарозного геля. И провести электрофорез для оценки размера фрагментов хроматина. Для оптимизации гомогенизация выполнялась в течение 15 секунд или 45 секунд на двух скоростях: 18 000 и 22 000 об/мин.

Во всех условиях ядра можно было отделить от остатков ткани, но выход был оптимальным при использовании более низкой скорости. Ядра также можно готовить, обтягивая в течение трех-пяти минут. Но механическая гомогенизация является предпочтительным методом, поскольку оптимальные выходы ядер могут быть достигнуты всего за 15 секунд, что позволяет значительно выиграть время, особенно если необходимо обрабатывать несколько образцов.

Используя этот протокол, можно выделить до 2,7 умножить на 10 до семи ядер из 500 мг ткани для получения 100 микрограммов хроматина. Полученный таким образом хроматин дает чистые, высококачественные результаты в экспериментах по секвенированию ChIP. Об этом свидетельствуют высокие уровни ацетилированного K27 гистона H3 и РНК-полимеразы 2 в мышечно-экспрессируемом локусе Десмонда.

Специфичность для мышечных волокон проявляется в низком или отсутствующем сигнале в локусах Pecam1 и Vcam1, которые не экспрессируются в мышцах. При выполнении этой процедуры важно правильно погрузить зонд гомогенизатора в образец, чтобы избежать вспенивания, очистить зонд между образцами и оптимизировать фрагментацию хроматина. Хроматин, полученный таким образом, был успешно использован для картирования занятости транскрипционного фактора в масштабах всего генома, а также должен быть пригоден для методов захвата подтверждения хроматина.

После своего развития этот метод проложил путь к исследованиям в области геномики, чтобы изучить регуляцию генов в скелетных мышцах мышей. Процедура также может быть применена к мышцам крыс и биопсии людей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать механическую гомогенизацию с последующей очисткой фиксированных формальдегидом ядер для подготовки хроматина из скелетных мышц к иммунопреципитации.

Не забывайте, что работа с формальдегидом, фенолом, хлороформом и протеиназой К может быть опасной. Следует соблюдать такие меры предосторожности, как ношение перчаток и очков. Действия, связанные с этими реагентами, должны выполняться под капотом.