Биолюминесцентный анализ АТФ

Биолюминесцентный анализ АТФ является распространенным методом, используемым для количественной оценки уровней АТФ и обнаружения живых, метаболически активных клеток. АТФ или аденозинтрифосфат является основным источником энергии для всех живых организмов, и под «всеми» мы подразумеваем ВСЕ. На клеточном уровне АТФ генерируется в результате набора метаболических процессов, называемых клеточным дыханием.

Сегодня мы кратко обсудим пути, участвующие в клеточном дыхании. Далее мы познакомимся с принципами биолюминесцентного анализа АТФ и пройдемся по пошаговому протоколу выполнения этого метода. Наконец, мы увидим, как ученые применяют эту технику в своих текущих исследованиях.

Давайте начнем с введения клеточного дыхания. Это явление включает в себя несколько метаболических процессов, но мы остановимся на том, который связан с метаболизмом глюкозы.

В цитоплазме путь гликолиза преобразует глюкозу в пируват и в процессе генерирует две молекулы АТФ. Пируват транспортируется в митохондрии, где он превращается в ацетил-коэнзим А — процесс, который также генерирует углекислый газ. Еще находясь в митохондриях, ацетил-коэнзим А затем вступает в цикл трикарбоновой кислоты или ТСА, во время которого снова образуется углекислый газ, а также высокоэнергетические молекулы НАДН и FADH2. Эти молекулы в конечном итоге «переносят» электроны в цепь переноса электронов или ETC.

В ETC электроны последовательно переносятся между различными белковыми комплексами во внутренней митохондриальной мембране, прежде чем превратить кислород в воду. Во время этого процесса протоны «закачиваются» в межмембранное пространство митохондрий. АТФ фактически образуется, когда эти протоны возвращаются в митохондриальный матрикс, проходя через белок под названием АТФ-синтаза. Вместе цикл ТСА и ETC приводят к синтезу 36 молекул АТФ. Расщепление других молекул питательных веществ, таких как жиры и белки, также может приводить к циклу ТСА и ETC, что приводит к производству АТФ.

Теперь, когда мы знаем, как клетки генерируют АТФ, давайте узнаем о принципах, лежащих в основе биолюминесцентного анализа АТФ, который обычно используется для измерения внутриклеточных уровней этой молекулы.

Структурно АТФ имеет адениновое основание, сахар рибозы и три фосфатные группы, последние из которых соединены высокоэнергетическими связями. Эти связи высвобождают энергию при разрыве, и биолюминесцентный анализ АТФ извлекает выгоду из этой энергии.

По сути, для этого анализа требуется соединение люциферина, которое получают из «светящихся» организмов, таких как светлячки, и соответствующий ему фермент катализатор под названием люцифераза. В присутствии кислорода люцифераза получает энергию из АТФ и превращает люциферин в оксилюциферин. Побочными продуктами этой реакции являются пирофосфат, представляющий собой две фосфатные группы, получаемые из АТФ, превращая его в аденозинмонофосфат или АМФ — углекислый газ, и свет, или люминесценция. Люминесценция считывается люминометром — машиной, которая количественно измеряет излучение света. Поскольку количество производимой люминесценции прямо пропорционально количеству АТФ, это служит хорошим индикатором жизнеспособности клеток и метаболизма.

Теперь, когда вы понимаете принципы, лежащие в основе биолюминесцентного анализа АТФ, давайте опишем общий протокол.

Сначала клетки засевают в 96-луночный планшет, содержащий питательные среды. Ячейки имеют различную плотность в трех экземплярах, чтобы учесть вариации, зависящие от плотности. Поскольку крайние скважины не окружены другими скважинами со всех четырех сторон, температура и скорость испарения в этих скважинах могут быть переменными. Таким образом, во внешних лунках не наносятся покрытия, а вместо этого они заполняются водой, чтобы избежать испарения по всей пластине и колебаний температуры, которые могут повлиять на реакцию. Затем планшеты инкубируют в течение ночи при 37°C, чтобы позволить клеткам прилипнуть к культуральным планшетам.

Затем среда удаляется, в каждую лунку добавляются люцифераза и люциферин, а пластина помещается в шейкер на 5–15 минут для облегчения реакции. Далее порция смеси из каждой лунки переносится на белую 96-луночную пластину; Часто используются белые пластины, поскольку они отражают свет вверх, что позволяет более точно считывать показания люминесценции. Кроме того, следует избегать образования пузырей, так как они могут помешать последующим анализам. Поскольку сигнал люминесценции со временем может уменьшаться, пластина считывается с люминометра в течение 10–12 минут.

Для анализа результатов люминометра рассчитывается среднее значение люминесценции из лунок с одинаковой плотностью ячеек. Сравнивая данные о люминесценции, собранные таким образом как из здоровых контрольных образцов, так и из обработанных клеток, исследователи могут оценить влияние конкретного лечения на жизнеспособность и метаболизм, в частности, путем поиска снижения люминесценции в экспериментальной группе.

Теперь, когда вы узнали, как провести анализ биолюминесценции АТФ, давайте обсудим его применение в исследованиях.

Ученые постоянно пытаются разработать новые противовирусные препараты, которые не причиняют вреда и не убивают клетки-хозяева. В этом исследовании клетки млекопитающих были посеяны в многолуночную пластину и инфицированы определенным вирусом. В эти образцы были добавлены различные противовирусные соединения, и были построены логарифмические кривые концентрация-реакция для расчета эффективной концентрации 50 или EC50. EC50 – это концентрация соединения, при которой жизнеспособность клеток составляет 50 процентов. Это часто используемый параметр для оценки цитотоксичности соединения.

Уровни АТФ также могут давать подсказки о митохондриальной активности при различных условиях. Здесь биолюминесцентный анализ АТФ был проведен на препаратах митохондрий, полученных из печени и мышечных клеток грызунов, что помогло исследователям оценить степень функции митохондрий в нормальных тканях. Важно отметить, что этот протокол может быть расширен, чтобы обеспечить способ изучения функции митохондрий при заболеваниях.

Ученые также используют этот анализ для изучения потенциальных методов лечения рака в системах in vivo. В этом примере опухолевые клетки человека были модифицированы для экспрессии люциферазы и введены в мозг живых мышей. После того, как опухолевые клетки укоренились у этих животных, их лечили противораковым препаратом. Последующий биолюминесцентный анализ in vivo показал, что опухолевые клетки у мышей, подвергшихся воздействию лекарств, имели более низкие уровни АТФ.

Вы только что посмотрели введение JoVE в биолюминесцентный анализ АТФ. Теперь вы должны быть знакомы с путями клеточного дыхания и протоколом, используемым для измерения АТФ, которая является конечным продуктом этих путей. Биолюминесцентный анализ АТФ служит отличным инструментом скрининга для клеточных биологов, заинтересованных в изучении влияния физиологических и патологических факторов на метаболизм и жизнеспособность клеток. Как всегда, спасибо за просмотр!