Биолюминесцентный анализ АТФ
Биолюминесцентный анализ АТФ является распространенным методом, используемым для количественной оценки уровней АТФ и обнаружения живых, метаболически активных клеток. АТФ или аденозинтрифосфат является основным источником энергии для всех живых организмов, и под «всеми» мы подразумеваем ВСЕ. На клеточном уровне АТФ генерируется в результате набора метаболических процессов, называемых клеточным дыханием.
Сегодня мы кратко обсудим пути, участвующие в клеточном дыхании. Далее мы познакомимся с принципами биолюминесцентного анализа АТФ и пройдемся по пошаговому протоколу выполнения этого метода. Наконец, мы увидим, как ученые применяют эту технику в своих текущих исследованиях.
Давайте начнем с введения клеточного дыхания. Это явление включает в себя несколько метаболических процессов, но мы остановимся на том, который связан с метаболизмом глюкозы.
В цитоплазме путь гликолиза преобразует глюкозу в пируват и в процессе генерирует две молекулы АТФ. Пируват транспортируется в митохондрии, где он превращается в ацетил-коэнзим А — процесс, который также генерирует углекислый газ. Еще находясь в митохондриях, ацетил-коэнзим А затем вступает в цикл трикарбоновой кислоты или ТСА, во время которого снова образуется углекислый газ, а также высокоэнергетические молекулы НАДН и FADH2. Эти молекулы в конечном итоге «переносят» электроны в цепь переноса электронов или ETC.
В ETC электроны последовательно переносятся между различными белковыми комплексами во внутренней митохондриальной мембране, прежде чем превратить кислород в воду. Во время этого процесса протоны «закачиваются» в межмембранное пространство митохондрий. АТФ фактически образуется, когда эти протоны возвращаются в митохондриальный матрикс, проходя через белок под названием АТФ-синтаза. Вместе цикл ТСА и ETC приводят к синтезу 36 молекул АТФ. Расщепление других молекул питательных веществ, таких как жиры и белки, также может приводить к циклу ТСА и ETC, что приводит к производству АТФ.
Теперь, когда мы знаем, как клетки генерируют АТФ, давайте узнаем о принципах, лежащих в основе биолюминесцентного анализа АТФ, который обычно используется для измерения внутриклеточных уровней этой молекулы.
Структурно АТФ имеет адениновое основание, сахар рибозы и три фосфатные группы, последние из которых соединены высокоэнергетическими связями. Эти связи высвобождают энергию при разрыве, и биолюминесцентный анализ АТФ извлекает выгоду из этой энергии.
По сути, для этого анализа требуется соединение люциферина, которое получают из «светящихся» организмов, таких как светлячки, и соответствующий ему фермент катализатор под названием люцифераза. В присутствии кислорода люцифераза получает энергию из АТФ и превращает люциферин в оксилюциферин. Побочными продуктами этой реакции являются пирофосфат, представляющий собой две фосфатные группы, получаемые из АТФ, превращая его в аденозинмонофосфат или АМФ — углекислый газ, и свет, или люминесценция. Люминесценция считывается люминометром — машиной, которая количественно измеряет излучение света. Поскольку количество производимой люминесценции прямо пропорционально количеству АТФ, это служит хорошим индикатором жизнеспособности клеток и метаболизма.
Теперь, когда вы понимаете принципы, лежащие в основе биолюминесцентного анализа АТФ, давайте опишем общий протокол.
Сначала клетки засевают в 96-луночный планшет, содержащий питательные среды. Ячейки имеют различную плотность в трех экземплярах, чтобы учесть вариации, зависящие от плотности. Поскольку крайние скважины не окружены другими скважинами со всех четырех сторон, температура и скорость испарения в этих скважинах могут быть переменными. Таким образом, во внешних лунках не наносятся покрытия, а вместо этого они заполняются водой, чтобы избежать испарения по всей пластине и колебаний температуры, которые могут повлиять на реакцию. Затем планшеты инкубируют в течение ночи при 37°C, чтобы позволить клеткам прилипнуть к культуральным планшетам.
Затем среда удаляется, в каждую лунку добавляются люцифераза и люциферин, а пластина помещается в шейкер на 5–15 минут для облегчения реакции. Далее порция смеси из каждой лунки переносится на белую 96-луночную пластину; Часто используются белые пластины, поскольку они отражают свет вверх, что позволяет более точно считывать показания люминесценции. Кроме того, следует избегать образования пузырей, так как они могут помешать последующим анализам. Поскольку сигнал люминесценции со временем может уменьшаться, пластина считывается с люминометра в течение 10–12 минут.
Для анализа результатов люминометра рассчитывается среднее значение люминесценции из лунок с одинаковой плотностью ячеек. Сравнивая данные о люминесценции, собранные таким образом как из здоровых контрольных образцов, так и из обработанных клеток, исследователи могут оценить влияние конкретного лечения на жизнеспособность и метаболизм, в частности, путем поиска снижения люминесценции в экспериментальной группе.
Теперь, когда вы узнали, как провести анализ биолюминесценции АТФ, давайте обсудим его применение в исследованиях.
Ученые постоянно пытаются разработать новые противовирусные препараты, которые не причиняют вреда и не убивают клетки-хозяева. В этом исследовании клетки млекопитающих были посеяны в многолуночную пластину и инфицированы определенным вирусом. В эти образцы были добавлены различные противовирусные соединения, и были построены логарифмические кривые концентрация-реакция для расчета эффективной концентрации 50 или EC50. EC50 – это концентрация соединения, при которой жизнеспособность клеток составляет 50 процентов. Это часто используемый параметр для оценки цитотоксичности соединения.
Уровни АТФ также могут давать подсказки о митохондриальной активности при различных условиях. Здесь биолюминесцентный анализ АТФ был проведен на препаратах митохондрий, полученных из печени и мышечных клеток грызунов, что помогло исследователям оценить степень функции митохондрий в нормальных тканях. Важно отметить, что этот протокол может быть расширен, чтобы обеспечить способ изучения функции митохондрий при заболеваниях.
Ученые также используют этот анализ для изучения потенциальных методов лечения рака в системах in vivo. В этом примере опухолевые клетки человека были модифицированы для экспрессии люциферазы и введены в мозг живых мышей. После того, как опухолевые клетки укоренились у этих животных, их лечили противораковым препаратом. Последующий биолюминесцентный анализ in vivo показал, что опухолевые клетки у мышей, подвергшихся воздействию лекарств, имели более низкие уровни АТФ.
Вы только что посмотрели введение JoVE в биолюминесцентный анализ АТФ. Теперь вы должны быть знакомы с путями клеточного дыхания и протоколом, используемым для измерения АТФ, которая является конечным продуктом этих путей. Биолюминесцентный анализ АТФ служит отличным инструментом скрининга для клеточных биологов, заинтересованных в изучении влияния физиологических и патологических факторов на метаболизм и жизнеспособность клеток. Как всегда, спасибо за просмотр!
У светлячков фермент люцифераза превращает соединение под названием люциферин в оксилюциферин и в результате производит свет или «люминесценцию». Для…
Биолюминесцентный анализ АТФ является распространенным методом, используемым для количественной оценки уровней АТФ и обнаружения живых, метаболически активных клеток. АТФ или аденозинтрифосфат является основным источником энергии для всех живых организмов, и под «всеми» мы подразумеваем ВСЕ. На клеточном уровне АТФ генерируется в результате набора метаболических процессов, называемых клеточным дыханием.
Сегодня мы кратко обсудим пути, участвующие в клеточном дыхании. Далее мы познакомимся с принципами биолюминесцентного анализа АТФ и пройдемся по пошаговому протоколу выполнения этого метода. Наконец, мы увидим, как ученые применяют эту технику в своих текущих исследованиях.
Давайте начнем с введения клеточного дыхания. Это явление включает в себя несколько метаболических процессов, но мы остановимся на том, который связан с метаболизмом глюкозы.
В цитоплазме путь гликолиза преобразует глюкозу в пируват и в процессе генерирует две молекулы АТФ. Пируват транспортируется в митохондрии, где он превращается в ацетил-коэнзим А — процесс, который также генерирует углекислый газ. Еще находясь в митохондриях, ацетил-коэнзим А затем вступает в цикл трикарбоновой кислоты или ТСА, во время которого снова образуется углекислый газ, а также высокоэнергетические молекулы НАДН и FADH2. Эти молекулы в конечном итоге «переносят» электроны в цепь переноса электронов или ETC.
В ETC электроны последовательно переносятся между различными белковыми комплексами во внутренней митохондриальной мембране, прежде чем превратить кислород в воду. Во время этого процесса протоны «закачиваются» в межмембранное пространство митохондрий. АТФ фактически образуется, когда эти протоны возвращаются в митохондриальный матрикс, проходя через белок под названием АТФ-синтаза. Вместе цикл ТСА и ETC приводят к синтезу 36 молекул АТФ. Расщепление других молекул питательных веществ, таких как жиры и белки, также может приводить к циклу ТСА и ETC, что приводит к производству АТФ.
Теперь, когда мы знаем, как клетки генерируют АТФ, давайте узнаем о принципах, лежащих в основе биолюминесцентного анализа АТФ, который обычно используется для измерения внутриклеточных уровней этой молекулы.
Структурно АТФ имеет адениновое основание, сахар рибозы и три фосфатные группы, последние из которых соединены высокоэнергетическими связями. Эти связи высвобождают энергию при разрыве, и биолюминесцентный анализ АТФ извлекает выгоду из этой энергии.
По сути, для этого анализа требуется соединение люциферина, которое получают из «светящихся» организмов, таких как светлячки, и соответствующий ему фермент катализатор под названием люцифераза. В присутствии кислорода люцифераза получает энергию из АТФ и превращает люциферин в оксилюциферин. Побочными продуктами этой реакции являются пирофосфат, представляющий собой две фосфатные группы, получаемые из АТФ, превращая его в аденозинмонофосфат или АМФ — углекислый газ, и свет, или люминесценция. Люминесценция считывается люминометром — машиной, которая количественно измеряет излучение света. Поскольку количество производимой люминесценции прямо пропорционально количеству АТФ, это служит хорошим индикатором жизнеспособности клеток и метаболизма.
Теперь, когда вы понимаете принципы, лежащие в основе биолюминесцентного анализа АТФ, давайте опишем общий протокол.
Сначала клетки засевают в 96-луночный планшет, содержащий питательные среды. Ячейки имеют различную плотность в трех экземплярах, чтобы учесть вариации, зависящие от плотности. Поскольку крайние скважины не окружены другими скважинами со всех четырех сторон, температура и скорость испарения в этих скважинах могут быть переменными. Таким образом, во внешних лунках не наносятся покрытия, а вместо этого они заполняются водой, чтобы избежать испарения по всей пластине и колебаний температуры, которые могут повлиять на реакцию. Затем планшеты инкубируют в течение ночи при 37°C, чтобы позволить клеткам прилипнуть к культуральным планшетам.
Затем среда удаляется, в каждую лунку добавляются люцифераза и люциферин, а пластина помещается в шейкер на 5–15 минут для облегчения реакции. Далее порция смеси из каждой лунки переносится на белую 96-луночную пластину; Часто используются белые пластины, поскольку они отражают свет вверх, что позволяет более точно считывать показания люминесценции. Кроме того, следует избегать образования пузырей, так как они могут помешать последующим анализам. Поскольку сигнал люминесценции со временем может уменьшаться, пластина считывается с люминометра в течение 10–12 минут.
Для анализа результатов люминометра рассчитывается среднее значение люминесценции из лунок с одинаковой плотностью ячеек. Сравнивая данные о люминесценции, собранные таким образом как из здоровых контрольных образцов, так и из обработанных клеток, исследователи могут оценить влияние конкретного лечения на жизнеспособность и метаболизм, в частности, путем поиска снижения люминесценции в экспериментальной группе.
Теперь, когда вы узнали, как провести анализ биолюминесценции АТФ, давайте обсудим его применение в исследованиях.
Ученые постоянно пытаются разработать новые противовирусные препараты, которые не причиняют вреда и не убивают клетки-хозяева. В этом исследовании клетки млекопитающих были посеяны в многолуночную пластину и инфицированы определенным вирусом. В эти образцы были добавлены различные противовирусные соединения, и были построены логарифмические кривые концентрация-реакция для расчета эффективной концентрации 50 или EC50. EC50 – это концентрация соединения, при которой жизнеспособность клеток составляет 50 процентов. Это часто используемый параметр для оценки цитотоксичности соединения.
Уровни АТФ также могут давать подсказки о митохондриальной активности при различных условиях. Здесь биолюминесцентный анализ АТФ был проведен на препаратах митохондрий, полученных из печени и мышечных клеток грызунов, что помогло исследователям оценить степень функции митохондрий в нормальных тканях. Важно отметить, что этот протокол может быть расширен, чтобы обеспечить способ изучения функции митохондрий при заболеваниях.
Ученые также используют этот анализ для изучения потенциальных методов лечения рака в системах in vivo. В этом примере опухолевые клетки человека были модифицированы для экспрессии люциферазы и введены в мозг живых мышей. После того, как опухолевые клетки укоренились у этих животных, их лечили противораковым препаратом. Последующий биолюминесцентный анализ in vivo показал, что опухолевые клетки у мышей, подвергшихся воздействию лекарств, имели более низкие уровни АТФ.
Вы только что посмотрели введение JoVE в биолюминесцентный анализ АТФ. Теперь вы должны быть знакомы с путями клеточного дыхания и протоколом, используемым для измерения АТФ, которая является конечным продуктом этих путей. Биолюминесцентный анализ АТФ служит отличным инструментом скрининга для клеточных биологов, заинтересованных в изучении влияния физиологических и патологических факторов на метаболизм и жизнеспособность клеток. Как всегда, спасибо за просмотр!
Биолюминесцентный анализ АТФ является распространенным методом, используемым для количественной оценки уровней АТФ и обнаружения живых, метаболически активных клеток. АТФ или аденозинтрифосфат является основным источником энергии для всех живых организмов, и под «всеми» мы подразумеваем ВСЕ. На клеточном уровне АТФ генерируется в результате набора метаболических процессов, называемых клеточным дыханием.
Сегодня мы кратко обсудим пути, участвующие в клеточном дыхании. Далее мы познакомимся с принципами биолюминесцентного анализа АТФ и пройдемся по пошаговому протоколу выполнения этого метода. Наконец, мы увидим, как ученые применяют эту технику в своих текущих исследованиях.
Давайте начнем с введения клеточного дыхания. Это явление включает в себя несколько метаболических процессов, но мы остановимся на том, который связан с метаболизмом глюкозы.
В цитоплазме путь гликолиза преобразует глюкозу в пируват и в процессе генерирует две молекулы АТФ. Пируват транспортируется в митохондрии, где он превращается в ацетил-коэнзим А — процесс, который также генерирует углекислый газ. Еще находясь в митохондриях, ацетил-коэнзим А затем вступает в цикл трикарбоновой кислоты или ТСА, во время которого снова образуется углекислый газ, а также высокоэнергетические молекулы НАДН и FADH2. Эти молекулы в конечном итоге «переносят» электроны в цепь переноса электронов или ETC.
В ETC электроны последовательно переносятся между различными белковыми комплексами во внутренней митохондриальной мембране, прежде чем превратить кислород в воду. Во время этого процесса протоны «закачиваются» в межмембранное пространство митохондрий. АТФ фактически образуется, когда эти протоны возвращаются в митохондриальный матрикс, проходя через белок под названием АТФ-синтаза. Вместе цикл ТСА и ETC приводят к синтезу 36 молекул АТФ. Расщепление других молекул питательных веществ, таких как жиры и белки, также может приводить к циклу ТСА и ETC, что приводит к производству АТФ.
Теперь, когда мы знаем, как клетки генерируют АТФ, давайте узнаем о принципах, лежащих в основе биолюминесцентного анализа АТФ, который обычно используется для измерения внутриклеточных уровней этой молекулы.
Структурно АТФ имеет адениновое основание, сахар рибозы и три фосфатные группы, последние из которых соединены высокоэнергетическими связями. Эти связи высвобождают энергию при разрыве, и биолюминесцентный анализ АТФ извлекает выгоду из этой энергии.
По сути, для этого анализа требуется соединение люциферина, которое получают из «светящихся» организмов, таких как светлячки, и соответствующий ему фермент катализатор под названием люцифераза. В присутствии кислорода люцифераза получает энергию из АТФ и превращает люциферин в оксилюциферин. Побочными продуктами этой реакции являются пирофосфат, представляющий собой две фосфатные группы, получаемые из АТФ, превращая его в аденозинмонофосфат или АМФ — углекислый газ, и свет, или люминесценция. Люминесценция считывается люминометром — машиной, которая количественно измеряет излучение света. Поскольку количество производимой люминесценции прямо пропорционально количеству АТФ, это служит хорошим индикатором жизнеспособности клеток и метаболизма.
Теперь, когда вы понимаете принципы, лежащие в основе биолюминесцентного анализа АТФ, давайте опишем общий протокол.
Сначала клетки засевают в 96-луночный планшет, содержащий питательные среды. Ячейки имеют различную плотность в трех экземплярах, чтобы учесть вариации, зависящие от плотности. Поскольку крайние скважины не окружены другими скважинами со всех четырех сторон, температура и скорость испарения в этих скважинах могут быть переменными. Таким образом, во внешних лунках не наносятся покрытия, а вместо этого они заполняются водой, чтобы избежать испарения по всей пластине и колебаний температуры, которые могут повлиять на реакцию. Затем планшеты инкубируют в течение ночи при 37°C, чтобы позволить клеткам прилипнуть к культуральным планшетам.
Затем среда удаляется, в каждую лунку добавляются люцифераза и люциферин, а пластина помещается в шейкер на 5–15 минут для облегчения реакции. Далее порция смеси из каждой лунки переносится на белую 96-луночную пластину; Часто используются белые пластины, поскольку они отражают свет вверх, что позволяет более точно считывать показания люминесценции. Кроме того, следует избегать образования пузырей, так как они могут помешать последующим анализам. Поскольку сигнал люминесценции со временем может уменьшаться, пластина считывается с люминометра в течение 10–12 минут.
Для анализа результатов люминометра рассчитывается среднее значение люминесценции из лунок с одинаковой плотностью ячеек. Сравнивая данные о люминесценции, собранные таким образом как из здоровых контрольных образцов, так и из обработанных клеток, исследователи могут оценить влияние конкретного лечения на жизнеспособность и метаболизм, в частности, путем поиска снижения люминесценции в экспериментальной группе.
Теперь, когда вы узнали, как провести анализ биолюминесценции АТФ, давайте обсудим его применение в исследованиях.
Ученые постоянно пытаются разработать новые противовирусные препараты, которые не причиняют вреда и не убивают клетки-хозяева. В этом исследовании клетки млекопитающих были посеяны в многолуночную пластину и инфицированы определенным вирусом. В эти образцы были добавлены различные противовирусные соединения, и были построены логарифмические кривые концентрация-реакция для расчета эффективной концентрации 50 или EC50. EC50 – это концентрация соединения, при которой жизнеспособность клеток составляет 50 процентов. Это часто используемый параметр для оценки цитотоксичности соединения.
Уровни АТФ также могут давать подсказки о митохондриальной активности при различных условиях. Здесь биолюминесцентный анализ АТФ был проведен на препаратах митохондрий, полученных из печени и мышечных клеток грызунов, что помогло исследователям оценить степень функции митохондрий в нормальных тканях. Важно отметить, что этот протокол может быть расширен, чтобы обеспечить способ изучения функции митохондрий при заболеваниях.
Ученые также используют этот анализ для изучения потенциальных методов лечения рака в системах in vivo. В этом примере опухолевые клетки человека были модифицированы для экспрессии люциферазы и введены в мозг живых мышей. После того, как опухолевые клетки укоренились у этих животных, их лечили противораковым препаратом. Последующий биолюминесцентный анализ in vivo показал, что опухолевые клетки у мышей, подвергшихся воздействию лекарств, имели более низкие уровни АТФ.
Вы только что посмотрели введение JoVE в биолюминесцентный анализ АТФ. Теперь вы должны быть знакомы с путями клеточного дыхания и протоколом, используемым для измерения АТФ, которая является конечным продуктом этих путей. Биолюминесцентный анализ АТФ служит отличным инструментом скрининга для клеточных биологов, заинтересованных в изучении влияния физиологических и патологических факторов на метаболизм и жизнеспособность клеток. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does ATP bioluminescence assay measure cell viability?
The ATP bioluminescence assay uses luciferase enzyme to convert luciferin into oxyluciferin, producing light proportional to ATP levels. Since ATP reflects cellular metabolism and energy status, luminescence intensity directly indicates cell viability. A luminometer quantifies light emission, allowing researchers to assess whether cells are metabolically active or compromised by treatment or disease.
Q2: What role does ATP play in cellular respiration?
ATP is the primary energy currency produced through cellular respiration, a series of metabolic processes including glycolysis, the TCA cycle, and the electron transport chain. Glycolysis generates two ATP molecules, while the TCA cycle and electron transport chain together produce 36 ATP molecules. This energy powers all cellular functions in living organisms.
Q3: Why are outer wells filled with water in the ATP bioluminescence assay protocol?
Outer wells in a 96-well plate lack surrounding wells on all sides, causing variable temperature and evaporation rates. Filling these wells with water prevents plate-wide evaporation and temperature fluctuations that could interfere with the assay reaction and compromise luminescence readings from experimental wells.
Q4: What is EC50 and how does it relate to antiviral compound testing?
EC50 is the concentration of a compound at which cell viability drops to 50 percent, serving as a standard parameter to assess cytotoxicity. In antiviral research, scientists use the ATP bioluminescence assay to generate concentration-response curves and calculate EC50 values, helping identify effective antiviral compounds that minimize harm to host cells.
Q5: How does the luciferase-luciferin reaction produce luminescence?
Luciferase enzyme uses energy from ATP to convert luciferin into oxyluciferin in the presence of oxygen. This reaction releases byproducts including pyrophosphate, carbon dioxide, and light or luminescence. The amount of light produced is directly proportional to ATP concentration, making it a reliable indicator of cellular energy status.
Q6: Why are white 96-well plates preferred for luminescence measurements?
White 96-well plates reflect light upward toward the luminometer detector, enabling more accurate and sensitive luminescence readings compared to other plate colors. This reflective property maximizes signal detection and reduces background noise, improving the reliability of ATP quantification in the assay.
Q7: How can the ATP bioluminescence assay reveal mitochondrial function in disease states?
The assay measures ATP production, which directly reflects mitochondrial activity and oxidative phosphorylation efficiency. By comparing ATP levels in healthy tissue mitochondria versus diseased preparations, researchers can assess whether mitochondrial dysfunction contributes to pathological conditions, providing insights into metabolic disruption in disease.
Главы в этом видео
0:00
Overview
0:57
Cellular Respiration
2:43
Principles Behind the ATP Bioluminescence Assay
4:09
General Protocol for Measuring ATP in Cells
6:04
Applications
7:56
Summary