Мониторинг влияние осмотического стресса на секреторные пузырьки и экзоцитоз

Общая цель этой комбинированной аналитической методологии состоит в том, чтобы предоставить информацию о том, как секреторные везикулы в клетках реагируют на физическую силу, такую как внеклеточное осмотическое давление, и как корректировки этих органелл в дальнейшем влияют на процесс экзоцитоза. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как: как секреторные везикулы напрямую реагируют на изменения во внеклеточной среде или на медикаментозное лечение? Основное преимущество этого подхода заключается в том, что он позволяет отслеживать прямое воздействие на везикулярное содержимое в живых клетках и позволяет различать изменения в их высвобождении reh-химических веществ до и после лечения экзоцитоза.

Чтобы получить плоскую поверхность дискового электрода, поместите электрод в держатель микрошлифовальной машины и скосите каждый электрод из углеродного волокна под углом 45 градусов. После этого отметьте капилляр для дальнейшего ознакомления с тем, как расположить поверхность дискового электрода под углом 45 градусов при размещении электрода рядом с клетками для измерения экзоцитоза. Для проведения амперометрической регистрации на отдельных ячейках необходимо установить только что скошенный и испытанный микроэлектрод из углеродного волокна в держатель электродов головного столика, который используется с потенциостатом.

Перед использованием поместите каждый микроэлектрод из углеродного волокна в тестовый раствор для контроля тока исследуемого состояния с помощью циклической вольтамперометрии. Для циклического вольтамперометрического сканирования подайте сигнал потенциала треугольника от отрицательных 0,2 вольт до положительных 0,8 вольт против электрода сравнения из хлорида серебра и серебра со скоростью 100 милливольт в секунду, чтобы обеспечить хорошую кинетику реакции. Для амперометрической регистрации экзоцитоза поместите чашку Петри с культивируемыми хромаффиновыми клетками в изотонический буфер на инвертированный микроскоп в клетке Фарадея.

Используйте нагревательный столик микроскопа для поддержания температуры 37 градусов Цельсия во время экспериментов с клетками. Затем с помощью малошумящего патч-зажима подайте постоянный потенциал в 700 милливольт на рабочий электрод. Для регистрации экзоцитоза хромаффинных клеток необходимо оцифровать сигнал на частоте 10 килогерц и применить внутренний фильтр нижних частот Бесселя на частоте 2 килогерц для фильтрации записанного сигнала.

Обратите внимание, что овальный дисковый электрод должен быть размещен плашмя поверх ячеек и параллельно поверхности чашки Петри. Кроме того, электроды снимаются со скоса в тот же день, что и эксперименты, чтобы обеспечить чистоту поверхности электродов. Чтобы стимулировать экзоцитоз клетки, необходимо расположить стеклянную микропипетку, наполненную пятимиллимолярным раствором хлорида бария, на расстоянии не менее 20 микрометров от клетки.

Затем подайте пятисекундный импульс инъекции пятимиллимолярного раствора хлорида бария на поверхность клетки, чтобы стимулировать экзоцитоз клетки. Поместите стволовую пипетку в раствор и стимулируйте экзоцитоз клеток, применяя импульс инъекции бария, регистрируя переходные процессы амперометрического тока в течение примерно трех минут. Чтобы сравнить экзоцитотические реакции в изотонических условиях с гипертоническими условиями, инкубируйте клетки в течение 10 минут в гипертоническом буферном растворе.

После этого введите импульс инъекции бария для стимуляции экзоцитоза и выполните трехминутную амперометрическую запись. Для получения обратимой реакции клеток снова инкубируйте клетки в течение 10 минут в изотоническом буферном растворе. Стимулируйте клетки, применяя импульс инъекции бария, и выполните трехминутную запись экзоцитозного ответа.

Чтобы изготовить электроды для измерения везикулярных квантовых размеров, подготовьте электрод из углеродного волокна диаметром пять микрометров. Под микроскопом с помощью скальпеля разрежьте углеродное волокно, выходящее из стеклянного наконечника, так, чтобы осталось всего от 30 до 100 микрометров. Используйте бутановое пламя для подготовки пламенного наконечника электрода из углеродного волокна.

Чтобы получить равномерно вытравленный наконечник электрода цилиндрической формы, удерживайте электрод из углеродного волокна цилиндрической формы во время его вращения. И поместите углеродное волокно, идущее от стекла, на синий край пламени бутана до тех пор, пока кончик углерода не приобретет красный цвет. После пламенного травления поместите электрод под микроскоп, чтобы оценить наконечник электрода.

Размер наконечника травленого электрода должен составлять от 50 до 100 нанометров в диаметре. Затем вставьте цилиндрический микроэлектрод с нанонаконечником в эпоксидный раствор на три минуты, после чего окуните наконечник электрода в раствор ацетона на 15 секунд. Это позволяет эпоксидной смоле герметизировать потенциальное пространство зазора между углеродным волокном и изолирующей газовой стенкой капилляра.

В то время как ацетон очищает эпоксидную смолу от протравленной поверхности электрода из углеродного волокна. Чтобы отверждать эпоксидную смолу, запекайте электроды в духовке на ночь при температуре 100 градусов Цельсия. Перед использованием проверьте установившийся ток каждого микроэлектрода из углеродного волокна с помощью циклической вольтамперометрии.

Для экспериментов используйте только электроды, которые показывают ток плато в диапазоне от 1,5 до 2,5 наноампер. Для измерения внутриклеточной амперометрии поместите клетки под микроскоп и используйте те же экспериментальные настройки потенциостата. Предотвратите значительные физические повреждения клетки.

Вставьте цилиндрический микроэлектрод с нанонаконечником в ячейку, добавив мягкое механическое усилие. Как раз достаточно протолкнуть электрод через плазматическую мембрану клетки и в цитоплазму клетки с помощью микроманипулятора. После введения, когда клеточная мембрана герметизирована вокруг цилиндрического электрода, начните амперометрическую запись in-situ в живой клетке.

При приложенном к электроду окислительном потенциале везикулы адсорбируются к поверхности электрода и стохастически разрываются. Следовательно, нет необходимости в каком-либо стимуле для запуска этого процесса. Чтобы определить осмотическое влияние на размеры везикулярных клеток, соберите измерения внутриклеточной цитометрии из группы клеток, которые были инкубированы в изотоническом и гипертоническом буфере в экспериментальных условиях.

Влияние внеклеточной осмоляльности на активность экзоцитоза представлено в виде частоты событий экзоцитоза, когда хромаффинные клетки стимулируются раствором бария в изотонических, затем гипертонических и, наконец, в изотонических условиях. Эти данные показывают ингибирование активности экзоцитоза в клетках, испытывающих осмотический стресс, и частичное восстановление может быть достигнуто после того, как клетки возвращаются в изотоническую среду. Контрольный эксперимент показывает частоту событий экзоцитоза после трех последовательных бариевых стимуляций хромаффинных клеток в изотонических условиях.

Это показывает, что многократная стимуляция барием в течение времени, используемого в этих экспериментах, вызывает снижение активности экзоцитоза за счет последовательной стимуляции клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять эти взаимодополняющие аналитические методы, которые позволят вам сравнить, как на секреторные везикулы и процесс экзоцитоза влияют изменения во внеклеточной среде.