Обнаружение активных форм кислорода

Активные формы кислорода, вырабатываемые в клетках, участвуют в гомеостазе тканей, клеточном старении и болезненных состояниях, таких как рак. Как следует из их названия, эти молекулы возникают из кислорода, который в природе существует в виде стабильной молекулы дикислорода, поскольку все его электроны спарены. Добавление одного неспаренного электрона делает его нестабильным и приводит к образованию супероксид-аниона — формы активных форм кислорода или АФК. Помимо супероксид-аниона, существует несколько типов реакционноспособных соединений с неспаренными электронами, уровень которых клетка стремится жестко контролировать.

В этом видео мы узнаем, как активные формы кислорода связаны с клеточным метаболизмом и болезнями, исследуем принципы анализа для их обнаружения с помощью флуоресцентного зонда, а также рассмотрим обобщенный протокол для этого анализа. Наконец, мы рассмотрим, как ученые реализуют этот метод в экспериментах сегодня.

Во-первых, давайте обсудим, как образуются активные формы кислорода, и рассмотрим их влияние на клеточный метаболизм и болезни.

Важным источником клеточных активных форм кислорода являются митохондрии. В норме во время клеточного метаболизма электроны транспортируются по цепочке белковых комплексов, что приводит к восстановлению молекулярного кислорода до воды и одновременному образованию АТФ. Несмотря на необычайную регуляцию этого процесса, электроны все же утекают, что приводит к образованию супероксид-аниона.

Присутствие супероксид-аниона быстро приводит к появлению других форм активного кислорода, таких как перекись водорода и гидроксильный радикал. Эти радикалы, которые обладают высокореакционноспособным неспаренным электроном, могут окислительно повреждать мембраны, ДНК и белки. Чтобы противодействовать этому, клетка поддерживает свой собственный запас антиоксидантов ферментов, таких как супероксиддисмутаза, или молекул, таких как витамин С, которые уменьшают количество свободных радикалов. Любой дисбаланс в этой защитной системе может привести к потенциально фатальной петле положительной обратной связи, что приводит к состоянию избыточного количества активных форм кислорода, известному как окислительный стресс.

Активные формы кислорода участвуют в инициации и прогрессировании рака. Еще одним вредным эффектом этих молекул является индукция клеточного старения, также известного как старение. «Свободнорадикальная теория старения» предполагает, что активные формы кислорода, вырабатываемые в клетках во время нормального метаболизма, вызывают клеточное старение и смерть.

До сих пор мы обсуждали негативные стороны этих высокореактивных молекул, но они играют положительную роль и в клеточной физиологии. Во время иммунных реакций, когда фагоциты поглощают патогены, клетки запускают «дыхательный взрыв», во время которого генерируется чрезмерное количество активных форм кислорода для окислительного разложения патогенов. Кроме того, они являются необходимыми промежуточными продуктами и регуляторами различных клеточных сигнальных путей и даже могут сигнализировать о гибели клеток, которые стали раковыми.

Чтобы количественно оценить эти влиятельные клеточные окислители, ученые используют молекулы, которые при окислении становятся флуоресцентными. Обычно используемым зондом для обнаружения активных форм кислорода является H₂DCFDA или дихлор-дигидро-флуоресцеиновый диацетат, нефлуоресцентный аналог флуоресцеина. При добавлении в клетки, его проницаемая природа позволяет ему пассивно диффундировать.

Затем внутриклеточные эстеразы катализируют реакцию гидролиза, в результате которой происходит расщепление ацетатных групп. Это делает соединение более полярным, так что оно удерживается внутри клетки. После окисления, которое включает в себя удаление атомов водорода широким спектром активных форм кислорода, нефлуоресцентный H2DCFDA превращается в высокофлуоресцентный дихлорфлуоресцеин или DCF. Это может быть прочитано и количественно определено с помощью планшетного ридера, проточного цитометра или флуоресцентной микроскопии.

Теперь, когда вы знаете, как работает этот анализ, давайте посмотрим, как он проводится в лабораторных условиях.

Начните с переноса клеток, выращенных в культуральной среде, в фосфатно-солевой буфер с последующим центрифугированием для их промывания. Удалите надосадочную жидкость и добавьте флуоресцентный зонд H₂DCFDA. Инкубируйте клетки, загруженные красителем, в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание. После инкубации промойте ячейки, чтобы удалить выгруженный краситель и переложите клетки в тарелку. На этом этапе могут быть добавлены экспериментальные индукторы окислительного стресса.

Когда клетки будут готовы к анализу, их можно вставлять в считыватель планшетов. Длины волн возбуждения и излучения заданы для флуоресцеина. После считывания пластин можно анализировать значения. Результаты показывают относительное количество активных форм кислорода между образцами в определенные моменты времени.

Теперь, когда мы рассмотрели фактический протокол, давайте посмотрим, как он применяется в экспериментах сегодня.

Исследователи часто используют этот метод для изучения механики фагоцитоза. Эта группа ученых хотела изучить способность рыбок данио вырабатывать иммунный ответ на разных стадиях развития. Как упоминалось ранее, фагоцитоз приводит к образованию активных форм кислорода с высоким содержанием активных веществ, или «дыхательному взрыву», который используется для уничтожения патогенов. Поскольку фермент NADPH-оксидаза является важным продуцентом АФК в фагоцитарных клетках, ученые индуцировали взрывной ответ, обрабатывая рыбок данио индуктором NADPH. Результаты показали, что среди эмбрионов рыбок данио, чья реакция «взрыва» была спровоцирована, те, кто через 72 часа после оплодотворения, показали более высокое развитие активных форм кислорода, чем те, кто был через 48 часов после оплодотворения.

Митохондриальная дисфункция, обусловленная повышенным содержанием активных форм кислорода, является патологическим признаком многих заболеваний. Таким образом, исследователи могут идентифицировать митохондриальную дисфункцию, измеряя уровень окислительного стресса. Здесь ученые загрузили H2DCFDA на нейроны, а затем установили образцы на флуоресцентный микроскоп. При добавлении окислительного стрессора, такого как перекись водорода, у клеточных тел наблюдалось внезапное увеличение флуоресценции, что может быть признаком митохондриальной дисфункции.

Предполагается, что астроциты защищают нейроны центральной нервной системы от окислительного стресса. Из-за этой важности эти исследователи стремились разработать анализ для обнаружения окислительного стресса в астроцитах в присутствии внешнего индуктора. Они сделали это путем инкубации астроцитов с перекисью водорода и флуоресцентным зондом для обнаружения активных форм кислорода. Последующую полученную флуоресценцию анализировали с помощью проточного цитометра. Было замечено, что астроциты, активированные при окислительном стрессе, попадают в область повышенной интенсивности флуоресценции, смещенную вправо.

Вы только что посмотрели видео JoVE об обнаружении активных форм кислорода или АФК. Подводя итог, в этом видео мы обсудили связь между активными формами кислорода, клеточным метаболизмом и болезнями. Затем мы рассмотрели принцип и процедуру анализа для определения активных форм кислорода. Наконец, мы рассмотрели, как исследователи применяют этот метод в своих исследованиях. Анализ все еще загадочной роли активных форм кислорода представляет большой интерес для клеточных биологов, а надежные измерения с помощью флуоресцентных зондов оказываются бесценными. Как всегда, спасибо за просмотр!