Характеристика расширений клеточной мембраны и изучения их роли в динамике адгезии клеток рака
26 марта 2018 г.
Это исследование свидетельствует о полезности и простота расширения измерение количественных клеточной мембраны и его корреляция клей способности клеток. Как пример мы показываем здесь что связанных с Dickkopf белком 3 (DKK3) способствует формированию более lobopodia и адгезии клеток в Адренокортикальной рак клеток в пробирке.
Общая цель состоит в том, чтобы определить влияние экспериментальных изменений на репертуар клеточного расширения и то, как он связан с функцией клеточной адгезии при раке. Этот метод может помочь определить ключевые роли репертуара удлинения клеточной мембраны в модулировании клеточного поведения, такого как клеточная адгезия, подвижность и инвазия. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она относительно проста в исполнении и может быть легко адаптирована к различным экспериментальным условиям.
Применение этого метода распространяется на нашу терапию или диагностику местнораспространенных или метастатических раковых опухолей, поскольку он помогает точно количественно оценить изменения в репертуаре расширения клеток, связанные с изменениями в опухолевых клетках в адгезивных и инвазивных способностях. Он также может быть применен к другим системам, таким как регуляция ионных каналов, которая, как известно, играет важную роль в формировании расширения клеток и нормальных физиологических процессах. Визуальная демонстрация и запись этого метода имеет решающее значение, так как подсчет шагов удлинения клеток сложен для изучения из-за тонкостей их внешнего вида.
За сутки до визуализации подсчитайте клетки SW 13, SW Neo и SW DKK3, выращенные в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа с помощью гемоцитометра. Поместите стерильные стеклянные покровные стекла в отдельные лунки из трех шестилуночных планшетов. Используйте отдельную пластину для каждой клеточной линии и наносите три клеточные линии с плотностью 5000 ячеек на лунку в эти шесть луночных планшетов.
Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах углекислого газа на ночь. На следующий день из каждой скважины отсасывают питательную среду. Затем промойте клетки в одном миллилитре теплой PBS.
Впоследствии добавьте по одному миллилитру 3,7-процентного формальдегида в каждую лунку, чтобы зафиксировать клетки. Оставьте клетки в фиксаторе на 10 минут. После того, как фиксация будет сделана, аспирируйте формальдегид.
Добавьте по одному миллилитру 0,05 процента кристаллического фиолета в каждую лунку, чтобы окрашивать клетки на 30 минут. Далее очистите лишнее пятно, промыв ячейки одним миллилитром деионизированной воды на лунку три раза. Далее нанесите каплю прозрачного монтажного реагента на предметное стекло с маркировкой.
Затем с помощью щипцов с тонкими наконечниками аккуратно извлеките покровные листы и положите их лицевой стороной вниз на монтажные реагенты. Установив все испачканные покровные стекла на предметные стекла, под световым микроскопом выберите 20 случайных видов неперекрывающихся ячеек из каждого покровного стекла. Сделайте микрофотографии с увеличением 400 для каждого поля зрения.
Затем наблюдайте и подсчитайте количество типов расширений в каждой из 20 репрезентативных ячеек. Используйте определения и текстовый протокол, чтобы определить классификацию расширения мембраны как filopodia, lobopodia или lamellipodia. При первом подсчете типов расширений ячеек может быть полезно сохранить эталонное изображение доступным для просмотра.
Если это возможно, подсчет вслепую по отношению к их экспериментальным образцам обеспечит дополнительную объективность. Определите среднее число расширений каждого типа на ячейку в каждой из трех исследованных линий клеток. Используйте одностороннюю anova для проверки того, является ли разница в среднем проценте удлинения клеточной мембраны между различными типами клеток статистически значимой.
За сутки до анализа с помощью гемоцитометра подсчитывают клетки SW 13, SW Neo и SW DKK3. Поместите эти ячейки с плотностью 100 000 ячеек на лунку в шесть луночных планшетов, используя по одной пластине для каждой из шести обозначенных временных точек, которые будут испытываться. Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах углекислого газа на ночь.
На следующий день достаньте тарелку из инкубатора и промойте клетки один раз теплыми ПБС. Затем добавьте 0,5 миллилитра однокомпонентного неферментативного раствора для диссоциации клеток в каждую лунку. Аккуратно перемешайте пластины, чтобы равномерно распределить добавленный раствор.
Инкубируйте планшеты с раствором в течение определенного времени. Отсасывайте обозначенную пластину в конце каждой временной точки. Вскоре после каждой аспирации промывайте клетки одним миллилитром теплого PBS.
Затем аккуратно постучите по пластине, чтобы отделить слабо прикрепленные ячейки. Повторите стирку вместе с прерывистым постукиванием еще два раза. Наконец, аспирируйте все оставшиеся PBS и зафиксируйте клетки, которые остались в пластине, с помощью одного миллилитра 3,7 процента формальдегида.
После того, как фиксация будет сделана, аспирируйте формальдегид. Затем добавьте по одному миллилитру 0,05 процента кристаллического фиалки в каждую лунку, чтобы окрашивать клетки. После того, как окрашивание будет завершено, удалите излишки пятна, промыв ячейки одним миллилитром деионизированной воды на лунку три раза.
Используя световой микроскоп с увеличением 100 силы, подсчитайте оставшиеся прикрепленные клетки в каждой лунке для каждой пластины. Затем определите процент ячеек, которые оставались отделенными в разные моменты времени для трех проверенных линий ячеек. Используя двустороннюю anova, тест различий и скорости отслоения клеток между тремя клеточными линиями является статистически значимым.
Кристаллические фиолетовые окрашенные контрольные клетки SW 13 и SW Neo образовали в основном филоподии и ламелиподии. Напротив, клетки, экспрессирующие DKK3, образовали больше лобоподий с почти полным отсутствием ламелиподий и очень небольшим количеством филоподий. Кроме того, обратите внимание на различия в полярности между клетками, экспрессирующими DKK3, и контрольными клеточными линиями.
На графике показана доля различных расширений клеток в трех тестируемых клеточных линиях. Обратите внимание, что значительно более высокая доля лобоподий в клетках, экспрессирующих DKK3. Линейные графики показывают процент клеток, которые остались прикрепленными к пластине после обработки раствором диссоциации для временных точек, указанных по оси X.
Во все моменты времени до 10 минут клетки, экспрессирующие DKK3, демонстрировали значительно более высокую силу прикрепления клеток по сравнению с контрольными клетками. После освоения эта техника может быть выполнена в течение одного-двух дней, в зависимости от вашей экспериментальной установки, если она выполнена правильно. При выполнении этой процедуры важно не забывать оценивать, как изменения в морфологии расширения клеток влияют на адгезивную способность.
После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как точно количественно измерять расширения клеток в связи с изменениями характеристик адгезии раковых клеток. Удачи и спасибо за просмотр.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается взаимосвязь между выростами клеточной мембраны и адгезией раковых клеток. В частности, показано, как белок Dickkopf-related protein 3 (DKK3) усиливает образование лобоподий и адгезивность клеток адренокортикальной карциномы in vitro.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Исследования рака
- Механизмы клеточной адгезии
Теоретические основы
- Выросты клеточных мембран играют важнейшую роль в поведении клеток.
- Изучение этих выростов может дать представление о подвижности и инвазивности раковых клеток.
- Методы количественного измерения необходимы для изучения поведения клеток.
- Известно, что DKK3 влияет на адгезивные свойства клеток.
Цель исследования
- Оценить влияние выростов клеточной мембраны на адгезию раковых клеток.
- Оценить роль DKK3 в стимулировании образования лобоподий.
- Разработать метод количественной оценки выростов и адгезии клеток.
Используемые методы
- Количественное измерение выростов клеточной мембраны.
- Эксперименты in vitro с клетками адренокортикальной карциномы.
- Анализ корреляции между формированием лобоподий и клеточной адгезией.
- Визуальные демонстрации для облегчения понимания методики измерения.
Основные результаты
- DKK3 значительно увеличивает образование лобоподий в раковых клетках.
- При увеличении мембранных выростов наблюдалось повышение адгезивности клеток.
- Разработанный метод прост и adaptable к различным экспериментальным условиям.
- Количественный анализ помогает понять поведение опухолевых клеток.
Выводы
- Выросты клеточной мембраны имеют критическое значение для понимания поведения раковых клеток.
- DKK3 играет значительную роль в обеспечении адгезии клеток посредством лобоподий.
- Данный метод может быть применен в других областях исследований, включая регуляцию ионных каналов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет исследователям в области биофармацевтики количественно связать фенотипы вытягивания мембраны раковых клеток с функциональными результатами адгезии, обеспечивая механистический анализ для валидации мишеней при поиске новых противоопухолевых препаратов. Путем установления корреляции между формированием лобоподий и повышенной силой прикрепления клеток, данный анализ повышает прогностическую достоверность при оценке модуляторов клеточного поведения, таких как DKK3 или связанные с ними пути. Этот подход представляет собой масштабируемую и воспроизводимую платформу для снижения рисков при проверке ранних гипотез о механизмах метастазирования и инвазии.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки того, как специфические молекулярные изменения влияют на репертоар мембранных выростов, связанных с адгезией и подвижностью раковых клеток.
- Практическая ценность: предоставляет систему слепой объективной классификации филоподий, лобоподий и ламеллиподий для снижения систематической ошибки наблюдателя при фенотипическом скрининге.
- Прогностическая ценность: позволяет снизить механистические риски, связывая фенотипы выростов с функциональными тестами на адгезию, что помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки при приоритизации мишеней.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: формирует стандартизированные количественные показатели (количество типов выростов и процент адгезии), подходящие для рабочих процессов высокопроизводительного скрининга с анализом изображений.
- Воспроизводимость: использование определенных протоколов фиксации, окрашивания и визуализации обеспечивает согласованность результатов в различных экспериментальных условиях и временных точках.
- Универсальность платформы: метод адаптируем к различным моделям рака и воздействиям пертурбагенов, что позволяет использовать его повторно в исследовательских проектах, направленных на изучение путей клеточной адгезии или мотильности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: позволяет напрямую моделировать адгезивные и инвазивные способности в установленной системе in vitro для адренокортикального рака — клинически значимого типа рака.
- Трансляционная преемственность: связывает молекулярные изменения (например, экспрессию DKK3) с фенотипическими изменениями мембранных выростов и функциональной адгезией, что способствует валидации мишеней в соответствии с биомаркерами.
- Обоснование дальнейших разработок: поддерживает принятие решений на доклиническом этапе, предоставляя статистически значимые количественные показатели (с помощью однофакторного и двухфакторного ANOVA) доли выростов и скорости открепления.
Интеграция в пайплайн и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска, поддерживая валидацию мишеней с помощью фенотипического скрининга и обеспечивая возможность трансляционных последующих исследований на доклинических моделях путем установления связи между молекулярными эффекторами и поведением, связанным с адгезией.
- Поисковая биология: способствует проверке гипотез путем количественной оценки того, как экспериментальные изменения (например, гиперэкспрессия DKK3) изменяют фенотипы мембранных выростов и коррелируют с функциональными изменениями адгезии.
- Скрининг: обеспечивает готовые к анализу количественные данные о типах выростов и силе прикрепления клеток, что позволяет проводить надежную оценку влияния соединений или генетических модификаций.
- Аналитика: использует статистические тесты (однофакторный ANOVA для пропорций выростов, двухфакторный ANOVA для скорости открепления) для определения значимых различий между условиями, что помогает в проведении сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывают молекулярные механизмы с фенотипическими результатами в системе, релевантной для конкретного заболевания, обеспечивая преемственность от этапа открытия до доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой простой и адаптивный метод, применимый к различным клеточным линиям и экспериментальным установкам, что способствует стандартизации и полезности метода в рамках разных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность в валидации мишени путем механистической связи фенотипов вытягивания мембран с функцией адгезии раковых клеток.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет слепого подсчета, определенных протоколов окрашивания и статистической валидации.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологической неопределенности при оценке мишени на ранних стадиях, что увеличивает эффективность использования капитала.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с учетом риска на основе количественных воспроизводимых данных, связывающих молекулярные эффекторы с адгезивно-зависимым злокачественным поведением.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, микроскопией и морфологической классификацией мембранных выростов.
- Необходимы световой микроскоп и оборудование для захвата изображений для визуализации при 400-кратном увеличении и оценки адгезии при 100-кратном увеличении.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для проведения слепого подсчета и единообразного применения определений выростов (филоподий, лобоподий, ламеллоподий).
- При адаптации метода следует учитывать использование различных клеточных линий, время инкубации и концентрацию раствора для диссоциации при соблюдении целостности протокола.
- Практические ограничения включают субъективность классификации выростов без надлежащего обучения и использования эталонных изображений, как указано в исходном материале.
