Визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в массиве капилляров
15 ноября 2017 г.
Этот протокол описывает изготовление малых, готовых к использованию кассеты, которые могут быть применены для визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в единый, тест, который прост в эксплуатации. В этом подходе капиллярные массив был использован для мультиплекс и высокоэффективного обнаружения целей ГИО.
Общая цель этой процедуры заключается в изготовлении небольшой, готовой к использованию кассеты, которую можно использовать для визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в одном простом в использовании тесте. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мультиплексного обнаружения нуклеиновых кислот, такие как генетически модифицированные организмы или обнаружение ГМО. Чтобы очистить капилляры, наденьте лабораторную форму, защитные очки и перчатки для химической защиты.
Поместите капилляры в стакан. Очистите капилляры 30 миллилитрами ацетона в течение пяти минут, чтобы удалить органику. А затем, промойте капилляры деионизированной водой.
Далее приготовьте раствор пираньи, налив в стакан около десяти миллилитров перекиси водорода. Затем добавьте в перекись водорода 30 миллилитров серной кислоты при медленном встряхивании, чтобы предотвратить перегрев. Следите за тем, чтобы раствор полностью покрывал капилляры не менее 30 минут.
Затем смойте раствор пираньи большим количеством воды. Промойте капилляры этанолом и деионизированной водой в течение пяти минут каждый. Высушите капилляры в сушильном шкафу.
Далее взвесьте базовую и зубчатую реагенты PDMS в соотношении один к одному в 50-миллилитровой пробирке. Как правило, смешивают пять граммов эластомерной основы с пятью граммами эластомерного отвердителя. Тщательно перемешивайте смесь в течение примерно пяти минут стеклянной палочкой.
Поместите стакан с PDMS в вакуумную банку-колокольчик на тридцать минут для дегазации. Затем медленно залейте PDMS в цилиндр формы из нержавеющей стали. Дайте PDMS затвердеть в течение трех часов в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия.
После отверждения PDMS удалить форму, вытащив форму с помощью цилиндра. Извлеките PDMS из цилиндра, разрезав скальпелем край формы. Трижды промойте PDMS этанолом и деионизированной водой.
Затем высушите опору PDMS азотом. Очистите нижнюю поверхность подложки PDMS как гидрофобную, замочив подложку PDMS в супергидрофобном слое на одну секунду. Затем просушите его в течение десяти минут при комнатной температуре.
Далее вставьте очищенные четырехмиллиметровые капилляры в отверстия опоры PDMS, оставив ноль целых пяти миллиметров капилляров за пределами верхней поверхности опоры PDMS. Убедитесь, что концы капилляров находятся на одном уровне. Чтобы сделать наружную поверхность капилляров и верхнюю поверхность подложки PDMS гидрофобными, добавьте 15 микролитров супергидрофобного покрытия поверх поверхности подложки PDMS.
Сушка на воздухе супергидрофобной модифицированной капиллярной решетки. Далее добавьте одну точку, шесть микролитров грунтовочной фиксирующей смеси из одного комплекта грунтовок для заполнения одного соответствующего капилляра капиллярного массива по заранее разработанному порядку. Закрепите массив в прозрачном колодце стандартного 96-луночного планшета с плоским дном и высушите массив при температуре 60 градусов Цельсия в течение не менее двух часов.
Чтобы собрать кассету, поместите загрузочный адаптер на верхнюю часть закрепленного массива. Убедитесь, что чашка адаптера просто покрывает открытые части всех десяти капилляров. Для приготовления реакционной смеси LAMP добавьте в смесь реагенты согласно текстовому протоколу и после добавления кальцина переведите реакционную смесь на вихрь в течение пяти секунд.
Аккуратно переверните трубку двадцать раз после добавления Bst-полимеразы. Следы ДНК, которые существуют в окружающей среде, можно устранить, предварительно очистив их одной молью на литр соляной кислоты перед сдачей смеси LAMP. Отсадите 20 микролитров реакционной смеси LAMP со стандартным наконечником объемом 100 микролитров.
Вставьте наконечник во входное отверстие загрузочного адаптера, чтобы зафиксировать его. Аккуратно введите реакционную смесь в чашку адаптера. Реакционная смесь быстро заполнит чашку, а затем нагрузит капилляры автоматически за счет капиллярной силы.
Снимите адаптер с фиксирующим наконечником и запечатайте лунку прозрачной герметизирующей пленкой, совместимой с ПЦР. Затем инкубируйте капиллярную решетку в инкубаторе при температуре 63 градуса Цельсия в течение одного часа. Чтобы получить изображения флуоресцентного излучения, используйте ультрафиолетовый фонарик, чтобы возбудить диссоциированный кальцин для излучения флуоресценции.
Делайте снимки с верхней части капиллярной решетки с помощью цифровой камеры или смартфона. При съемке убедитесь, что камера максимально приближена к области капилляров, чтобы получить высококачественные и четкие изображения. Затем откройте изображение с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
А затем выберите изображение, форму, оттенки серого, да и изображение, форму, 16-бит, да. Выберите файл, сохранить как, формат, TIFF, чтобы преобразовать изображение в 16-битный формат TIFF. Чтобы извлечь значение интенсивности флуоресценции, откройте программное обеспечение для анализа микрочипов.
Перетащите 16-битное изображение в формате TIFF в интерфейс программного обеспечения, а затем выберите длину волны 532 нанометра и зеленый цвет для отображения изображения. Затем создайте новый блок для определения местоположения сигнала флуоресценции от капилляров. Выберите инструменты, новые блоки, а затем отдельно укажите количество столбцов и строк как «один к одному» и «два к пяти».
Щелкните правой кнопкой мыши и выберите модель функций. Затем отрегулируйте расположение и диаметр в соответствии с площадью флуоресценции капилляров. Выберите «Анализировать», чтобы извлечь значение интенсивности флуоресценции.
Наконец, выберите файл, сохранить настройки как, чтобы сохранить документы блока. Затем выберите, сохраните, сохраните результаты, чтобы сохранить результаты интенсивности флуоресценции. Здесь показана схема расположения капиллярного массива.
Капилляры с первого по восьмой, с префиксом LAMP primer sets. Капилляры девять и десять представляют собой два, без контроля праймера. Здесь показана флуоресцентная фотография для обнаружения генетически модифицированной кукурузы, MON863, где зеленый цвет представляет положительное усиление LAMP.
Успешная амплификация, представленная только в ожидаемых капиллярах один, шесть, семь и восемь, без контаминации среди пустых капилляров. Эта флуоресцентная фотография предназначена для обнаружения смеси ГМО. Зеленый цвет обозначал положительное усиление LAMP.
Успешная амплификация представлена только в ожидаемых капиллярах один, четыре, пять, шесть, семь и восемь без контаминации среди пустых капилляров. Показанная здесь флуоресцентная фотография предназначена для обнаружения негенетически модифицированной кукурузы, где зеленый цвет представляет положительное усиление LAMP. Успешная амплификация представлена только в ожидаемых восьми капиллярах, причем без загрязнения среди чистых капилляров.
После освоения эта процедура обнаружения может быть выполнена за пять часов, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготовить кассету на основе капилляров для обнаружения множественных нуклеиновых кислот.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается изготовление небольшой готовой к использованию кассеты для визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в рамках одного простого в эксплуатации теста. Этот метод особенно полезен для обнаружения генетически модифицированных организмов (ГМО) с использованием капиллярного массива для мультиплексного детектирования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биотехнология
- Молекулярная биология
- Генная инженерия
Теоретические сведения
- Детекция нескольких видов нуклеиновых кислот имеет решающее значение в различных областях.
- Генно-модифицированные организмы (ГМО) создают серьезные проблемы в области безопасности пищевых продуктов.
- Для проведения экспресс-анализа необходимы эффективные методы детекции.
- Капиллярные массивы могут расширить возможности мультиплексной детекции.
Цель исследования
- Разработать удобную кассету для детектирования нуклеиновых кислот.
- Повысить эффективность обнаружения ГМО.
- Способствовать проведению исследований в области мультиплексного детектирования нуклеиновых кислот.
Используемые методы
- Изготовление небольшой кассеты для детектирования нуклеиновых кислот.
- Использование капиллярных массивов для мультиплексного детектирования.
- Очистка капилляров ацетоном и деионизированной водой.
- Методы визуального детектирования для удобства использования.
Основные результаты
- Кассета позволяет одновременно обнаруживать несколько видов нуклеиновых кислот.
- Капиллярные массивы повышают эффективность процесса детектирования.
- Метод прост в исполнении и удобен для пользователя.
- Возможные области применения включают обнаружение ГМО и другие сферы.
Выводы
- Данный протокол представляет собой новый подход к детекции нуклеиновых кислот.
- Разработанная кассета эффективна для мультиплексного тестирования.
- Будущие исследования могут расширить возможности ее применения в биотехнологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данная платформа обеспечивает мультиплексное детектирование нуклеиновых кислот в одной кассете, что отвечает потребностям высокопроизводительного скрининга при тестировании ГМО и микробиологическом мониторинге. Благодаря сочетанию технологии капиллярных массивов с амплификацией LAMP, она снижает сложность анализа и требования к ресурсам, сохраняя при этом специфичность и чувствительность. Визуальный считываемый результат при УФ-освещении позволяет быстро получать данные без использования приборов, что соответствует требованиям к децентрализованному тестированию в рабочих процессах биофармацевтики и сельскохозяйственной биотехнологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает одновременное исследование нескольких генетических мишеней для проверки гипотез при анализе сигнальных путей.
- Практическая ценность: снижает расход реагентов и время непосредственной работы за счет загрузки образцов под действием капиллярных сил.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает использование стандартизированных изолированных реакционных камер для воспроизводимой амплификации различных мишеней.
- Практическая ценность: Позволяет проводить параллельную обработку до восьми анализов с использованием внутренних контролей для валидации анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает обнаружение генетически модифицированных элементов в сложных матрицах, что способствует оценке безопасности ГМО.
- Практическая ценность: позволяет проводить тестирование в полевых условиях с минимальным набором оборудования, что подходит для мониторинга технологических процессов в биопроизводстве.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод подходит для этапов от раннего поиска до доклинических исследований, когда экспресс-профилирование нуклеиновых кислот позволяет определить подходящие мишени и подготовить аналитические системы.
- Открывающая биология: позволяет проводить параллельное тестирование вариантов генов или конструкций для уточнения их функциональной роли в биологических путях.
- Скрининг: генерирует количественные данные об интенсивности флуоресценции для подтверждения хитов и межkapиллярного сравнения.
- Аналитика: выходные данные позволяют устанавливать пороги сигнала и оценивать уровень загрязнения с помощью контрольных холостых капилляров.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от идентификации мишени до доклинической валидации за счет стабильных показателей считывания нуклеиновых кислот.
- Корпоративное повторное использование: конструкция кассеты позволяет использовать ее для нескольких панелей нуклеиновых кислот путем реконфигурации наборов праймеров.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов в мультиплексных анализах за счет минимизации перекрестных помех и ложноположительных результатов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированной подготовке капилляров и изоляции объемов реакций.
- Стратегическая ценность: Сокращает время получения результатов для принятия критических решений при обнаружении ГМО и микробиологическом мониторинге.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию целей с учетом рисков на основе одновременного считывания нескольких параметров.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области обработки поверхностей и сборки капиллярных массивов для создания гидрофобного/гидрофильного паттернирования.
- Необходим доступ к оборудованию для вакуумного дегазирования и термического отверждения при изготовлении микрофлюидных устройств из PDMS.
- Требуется стандартизация протоколов фиксации праймера в капиллярных массивах для обеспечения воспроизводимости результатов.
- При увеличении количества мишеней более восьми необходимо учитывать особенности адаптации метода из-за ограничений капиллярного массива.
- Требуется обучение пользователя правилам проведения УФ-возбуждения и захвата изображений для обеспечения точности количественного анализа флуоресценции.
