Сайт направлен иммобилизации костных морфогенетических белка 2 для твердых поверхностей по химии нажмите

Общей целью данного исследования является надежное и воспроизводимое производство остеогенного каркаса путем сайт-направленного и ковалентного связывания недавно разработанного варианта BMP2 с помощью клик-химии. Этот метод может помочь преодолеть проблемы, связанные с широко используемыми методами лечения незаживающих дефектов длинных костей. Методы абсорбции или инкапсуляции требуют сверхфизиологических количеств BMP2, которые вызывают ряд серьезных побочных эффектов.

Основным преимуществом этой технологии является использование меньшего количества нового варианта БМП2, ковалентно связанного с лесами в сторону. Размножите одну колонию в течение ночи в 50 миллилитрах LB среды с 50 микрограммами на миллилитр канамицина и 100 микрограммами на миллилитр ампициллина при 37 градусах Цельсия. Разбавьте ночные культуры от одного до 20 до 800 миллилитров потрясающего бульона с добавлением 50 микрограмм на миллилитр канамицина и 100 микрограммов на миллилитр ампициллина.

Выращивайте культуры при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет достигнута оптическая плотность в 600 нанометров 0,7. Затем добавьте пропофол L-Lycine до конечной концентрации 10 миллимоляров. Индуцирование экспрессии генов путем добавления IPTG для конечной концентрации одного миллимолара.

Выращивайте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов в орбитальном вибростенде со скоростью 180 оборотов в минуту. После инкубации центрифугируйте всю культуру при 9 000 г в течение 30 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте бактериальную гранулу в 30 миллилитрах буфера TBSE.

Взвесьте пустой стакан центрифуги и переложите повторно взвешенную гранулу в пустой стакан. Затем центрифугируйте повторно суспендированную гранулу при 6, 360 раз g в течение 20 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и взвесьте стакан с гранулой.

Вычтите вес пустого стакана, чтобы рассчитать вес гранулы. Затем повторно суспендируйте гранулу в STE-буфере. Используйте 200 миллилитров STE-буфера на каждые 10 граммов гранул.

Ультразвуком нанесите суспензию на лед перед центрифугированием при 6, 360 раз g в течение 20 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и взвесьте гранулы. Повторив четыре раза этапы ультразвуковой обработки и центрифугирования, повторно суспендируйте гранулу в 100 миллилитрах буфера TBS.

Центрифугируйте при 6, 360 раз g в течение 20 минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и взвесьте гранулу. Повторно суспендируйте гранулу в нуклеазном буфере со свежедобавленной нуклеазой из расчета 10 миллилитров на грамм гранулы.

Инкубировать суспензию в течение ночи при комнатной температуре на перемешивающей пластине при 30 об/мин. На следующий день добавьте в суспензию Triton Buffer. Объем добавляемого буфера Triton соответствует 0,5 объемной части суспензии.

После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре центрифугировать суспензию при 6, 360 раз g в течение 20 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и взвесьте гранулы. Затем повторно суспендируйте гранулу в буфере TE, используя восемь миллилитров на грамм гранулы.

После центрифугирования, как и раньше, выбросьте надосадочную жидкость и взвесьте гранулу. Теперь повторно суспензируйте гранулу, добавив четыре миллилитра на грамм 25 миллимолярного ацетата натрия, PH5, и пять миллилитров на грамм шести моляров хлорида гуанидиния с одним миллимолярным DTT. Выдерживайте суспензию в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на пластине для перемешивания.

После центрифугирования при 75, 500 мг g в течение 20 минут надосадочная жидкость содержит развернутый мономерный белок BMP2. Соберите надосадочную жидкость и сконцентрируйте этот экстракт до оптической плотности на миллилитр 20 с помощью отсечки молекулярной массы в три килодальтоны в концентрирующей ячейке. Добавляйте концентрированные мономеры в отдельных каплях в буфер для ренатурации во время помешивания.

Затем инкубируйте раствор при комнатной температуре в течение 120 часов в темноте. Отрегулируйте pH раствора до 3,0 с помощью концентрированной соляной кислоты перед диализом раствора в отношении одной миллимолярной соляной кислоты. Концентрируйте диализованный раствор с помощью мембраны с молекулярной массой 10 килодальтон в концентрационной ячейке.

Далее загрузите белковый раствор в уравновешенную колонку, разбавьте фракции с помощью линейного градиента буфера В, собрав две миллилитровые фракции. Проанализируйте 20 микролитров каждой фракции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле SDS с последующим окрашиванием Coomassie Brilliant Blue для определения фракций, содержащих мономеры, и фракций, содержащих димеры. Далее вытягиваем димер, содержащий фракции.

Диализируйте ванну с димерсодержащими фракциями на ночь при четырех градусах Цельсия против пяти литров одной миллимолярной соляной кислоты. Концентрируйте продукт с помощью концентрирующего центробежного фильтра мощностью 10 килодальтон перед анализом конечного продукта с помощью SDS-PAGE и окрашивания Coomassie Brilliant Blue. Соедините 20 микромоляров BMP2-K3Plk или BMP2-while, которые используются в качестве отрицательного контроля, с 20 микролитрами активированных Азидом агарозных шариков в реакционном буфере общим объемом 500 микролитров.

Инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре на вращающейся смеси со скоростью 20 об/мин. Остановите реакцию, добавив конечную концентрацию пяти миллимоляров ЭДТА. Инкубируйте раствор при комнатной температуре в течение 15 минут на вращающемся смесителе со скоростью 20 об/мин.

Затем центрифугируйте образцы при 20 000 раз g в течение одной минуты при комнатной температуре и соберите надосадочную жидкость. Затем промойте гранулу, содержащую гранулы, 1 000 микролитрами HBS 500 Buffer. Центрифугируйте образец при 20 000 раз g в течение одной минуты при комнатной температуре и соберите надосадочную жидкость.

Повторите эту процедуру промывания еще два раза с HBS 500 Buffer, три раза с четырьмя молярами хлорида магния и два раза с PBS, каждый раз собирая надосадочную жидкость. Храните соединенные шарики в 1000 микролитров PBS при температуре четыре градуса Цельсия. Проведите анализ ЩФ, как описано в текстовом протоколе.

Для окрашивания ЩФ культивируют промышобластные клетки C2C12 в DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, а также 100 ЕД на миллилитр пенициллина G и стрептомицина при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере с 5% углекислым газом. Подавайте C2C12 клетки с плотностью 30 000 клеток на лунку в 96-луночный микропланшет. Дав ячейкам прикрепиться на ночь, удалите среду и добавьте 20 микролитров в лунку спаренных шариков PMB2-K3PLK.

Затем добавьте по 20 микролитров агарозы с низкой температурой плавления 0,4% в каждую лунку. Центрифугируйте 96-луночный микропланшет при 2000 умноженных на g в течение пяти минут при 20 градусах Цельсия. Затем добавьте 80 микролитров того же средства.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с содержанием углекислого газа 5% в течение 72 часов. После инкубации удалите среду, стараясь не отделить затвердевшую 0,4%-ную агарозу. Добавьте 100 микролитров на лунку одноступенчатого субпрямого раствора MBT-BCIP.

Анализируйте окрашивание щелочным фосфатидатом с помощью световой микроскопии сразу после того, как фиолетовое окрашивание становится очевидным. Используйте светлопольную микроскопию и делайте снимки. Биологическая активность вновь полученного варианта BMP2-K3Plk подтверждается индукцией экспрессии гена щелочной фосфатазы в клетках C2C12.

Тест in vitro показывает сходные уровни экспрессии генов щелочной фосфатазы, индуцированные либо типом BMP2, либо BMP2-K3Plk. Гранулы, покрытые BMP2-K3Plk с помощью катализируемого покрытием азидного алкинового циклоприсоединения, получали флуоресцентные вещества при инкубации с димаркированным экодоменом рецептора BMP 1A. Связывание рецептора BMP 1A с BMP2-K3Plk подтверждает сохранение биологической активности после спаривания.

Биологическая активность функционализированных шариков BMP2-K3Plk была доказана с помощью ALP-опосредованного окрашивания. Окрашивание происходило только в тех клетках, которые находились в непосредственном контакте с функционализированными гранулами BMP2-K3Plk, подтверждая, что белок действительно ковалентно связан с гранулами, а не просто поглощается. Если бы белок высвобождался в абсорбированном состоянии, наблюдалось бы более рассредоточенное окрашивание на больших расстояниях, как это видно здесь при окрашивании щелочной фосфатазой при обработке растворимым BMP2-K2Plk.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как экспрессировать и производить биологически активные белки путем генетической экспансии и как ковалентно связать беллетризованный белок с микросферами с помощью химической реакции клика. Генерация белковой изменчивости путем генетической экспансии позволяет, в принципе, вводить искусственную аминокислоту в любое положение первичной белковой последовательности. Введение мутации в последовательность BMP2 может повлиять на эффективность повторного сворачивания, а также может изменить параметры белка.

Производство БМП2-К3Плк потребовало модификации установленного метода выражения типа БМП2. Полученный BMP2-K3Plk показал биологическую активность, сравнимую с биологической активностью белка типа while. Наш подход к ковалентному связыванию варианта BMP2 с азирными беллетризованными шариками агарозы с помощью клик-химии может быть реализован с высокой эффективностью, что приведет к беллетризованным гранулам, определяющим генетическую дифференциацию in vitro.

Должна быть обеспечена стандартная защита в соответствии с надлежащей лабораторной практикой.