Роман В Vitro Live изображений Assay экзоцитоз-опосредованной с помощью фагоцитоза pH индикатор конъюгированных синаптосомах

Этот протокол представляет в vitro жить изображений фагоцитоза assay для измерения фагоцитарной способности астроциты. Астроциты очищенный крыса и микроглии используются наряду с синаптосомах конъюгированных показатель рН. Этот метод может обнаружить реального времени полного охвата контейнера пламенем и деградации кинетики и предоставляет платформу подходящий скрининг для выявления факторов, модулирует экзоцитоз фагоцитоза.

Общая цель этого эксперимента заключается в том, чтобы обнаружить кинетику поглощения и деградации глиальных клеток, таких как астроциты и микроглии, в реальном времени с помощью визуализации in vitro фагоцитоза синаптосом, конъюгированных с индикатором pH. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как регулируется фагоцитоз глиальных клеток в здоровом и больном мозге. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем эффективно контролировать и анализировать фагоцитарную кинетику глиальных клеток в реальном времени с помощью визуализации культивируемых клеток in vitro в реальном времени.

Этот метод также может быть использован для скрининга факторов и соединений, которые регулируют поглощающую и деструкционную способность глиальных клеток. Начните с центрифугирования размороженных образцов синаптосомы в течение трех-четырех минут при температуре 21 092 G и четырех градусах Цельсия. После отсасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах 0,1 молярного карбоната натрия на пробирку, добавив два микролитра индикатора pH в каждый образец после того, как они будут тщательно перемешаны.

После легкого вихря защитите растворы от света крышками из алюминиевой фольги, а образцы поместите в шейкер с легким перемешиванием на два часа при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте один миллилитр PBS Дульбекко, или DPBS, и соберите синаптосомы центрифугированием, повторно суспендируя гранулу в одном миллилитре свежего DPBS на одну промывку. После последнего центрифугирования повторно суспендируйте нефункциональную синаптосомную гранулу в 200 микролитрах DPBS с добавлением 5% ДМСО.

Для визуализации поглощения синаптосомы в реальном времени сначала удалите надосадочную жидкость из каждой лунки сливающейся культуры астроцитов и быстро промойте клетки три раза одним миллилитром DPBS за промывку. После последней промывки добавьте 300 микролитров иммунопанированной основной среды астроцитов и пять микролитров конъюгированных синаптосом, указанных в индикаторе pH, а также любые дополнительные факторы, которые могут модулировать фагоцитоз глиальных клеток. Позвольте синаптосомам осесть на дно лунок и прикрепиться к фосфатидилсериновым рецепторам на астроцитах при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

Через 40 минут выбросьте надосадочную жидкость и быстро, но аккуратно промойте лунки три раза одним миллилитром DPBS на одну промывку. После последней промывки добавьте 500 микролитров свежей среды, дополненной интересующими факторами, в соответствующие лунки и перенесите пластину на живой прибор для визуализации. Выберите положения изображения, отрегулируйте фокусировку, время экспозиции, яркость и мощность светодиодов, а также установите формат изображения, временной интервал и общее количество циклов для изображения в реальном времени в соответствии с экспериментами.

Затем начните визуализацию экспериментов по фагоцитозу в реальном времени. В соответствующей экспериментальной конечной точке откройте программу анализа imagine и импортируйте последовательность изображений замедленной съемки. Преобразуйте изображения в 8-битные оттенки серого и инициируйте вычитание фона с радиусом скользящей полосы 50 пикселей.

Затем откройте плагин Time Series Analyzer V3 и перетащите интересующую область в плагин. В менеджере интересующих регионов нажмите кнопку Добавить. В подключаемом модуле Временные ряды V3 нажмите Получить общую интенсивность.

Затем сохраните результаты и интегрируйте данные. После их получения синаптосомы экспрессируют фосфатидилсерин на своих внешних мембранах, что указывает на потерю функции, и это может быть распознано рецепторами фосфатидилсерина на астроцитах и микроглии. По мере того, как конъюгированные с индикатором pH синаптосомы фагоцитируются, они испускают ярко-красные флуоресцентные лампы.

Для количественной оценки фагоцитоза глиальных клеток можно измерить площадь красного флуоресцентного сигнала, или фагоцитарный индекс. Несмотря на то, что астроциты эффективны в фагоцитозе большого количества синаптосом, конъюгированных с индикатором pH, микроглия быстрее поглощает и разрушает синаптосомы. Интересно, что факторы, секретируемые астроцитами, которые содержатся в кондиционированной среде астроцитов, необходимы для увеличения фагоцитоза, опосредованного как астроцитами, так и микроглией.

Кроме того, мышиные астроциты с нокаутом MEGF10 продемонстрировали значительно сниженную фагоцитарную способность по сравнению с клетками дикого типа. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии и биологии глиальных клеток к изучению механизмов, участвующих в модуляции фагоцитоза глиальных клеток в качестве потенциального метода лечения различных неврологических расстройств.