Предварительного кондиционирования Airways мышей с блеомицин увеличивает эффективность приживления клеток рака легких ортотопическая

Общая цель этой процедуры заключается в повышении эффективности трансплантации клеток рака легких, инициирующих опухоль, в дыхательные пути мышей. Этот метод может помочь создать новые доклинические модели, чтобы ответить на ключевые вопросы биологии рака, включая причины лекарственной устойчивости и взаимосвязь между фиброзом и раком легких. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она повышает эффективность трансплантации клеток, инициирующих опухоль, в легкие различных линий мышей.

Применение этого метода распространяется и на терапию, поскольку он позволяет нам моделировать большее разнообразие подтипов рака легких человека, которые, как известно, имеют различные клинические реакции на лечение. Для этого протокола мышам сначала необходимо ввести блеомицин. Затем, через 14 дней, опухолевые клетки вводятся введенными внутрь.

Процедура обеих инъекций очень похожа и описана здесь. За два часа до инъекции разморозьте запас блеомицина на льду и разведите его до рабочей концентрации. Держите его на льду.

Для клеточного болюса приготовьте клеточную суспензию, как описано в текстовом протоколе. Время процедуры для каждой мыши составляет около 10 минут в совокупности. Обязательно подтвердите правильную анестезию, ущипнув палец ноги, и нанесите ветеринарную мазь на глаза.

В это время, если у мыши темные волосы, побрейте всю область ребер как вентрально, так и дорсально, чтобы ее можно было правильно изобразить. Затем поместите мышь на платформу для интубации, закрепив ее за передние зубы спиной к платформе. Если необходимо ввести клеточный болюс, ресуспендируйте его сейчас с помощью мягкого растирания.

Теперь осветите верхнюю часть грудной клетки, откройте рот и аккуратно вытяните язык с помощью плоских щипцов. Подготовьте внутривенный катетер для трахеи, удалив иглу, затем расположите ее над отверстием в трахее. Затем вставьте катетер в трахею до тех пор, пока верхняя часть катетера не окажется рядом с передними зубами, и осветите внутреннюю часть катетера, чтобы подтвердить его размещение.

Затем введите 50 микролитров свежеприготовленного блеомицина, или клеточной суспензии, непосредственно в катетер. Подождите несколько секунд, пока весь объем жидкости не пройдет вниз по катетеру. Затем извлеките катетер и утилизируйте его в 10% отбеливателе.

Если мышь не вдыхает жидкость, внимательно следите за ее дыханием и отрегулируйте положение катетера. Если мышь перестает дышать, немедленно извлеките катетер и дайте ей подышать, прежде чем снова вставлять катетер. После удаления катетера продолжайте выполнять процедуру, чтобы пять обработанных мышей, все еще находящихся под наркозом и готовых к визуализации.

Для восстановления поместите мышь лежа на грелку, одобренную IACUC, в клетке для восстановления и наблюдайте за ней до полного восстановления. Через две-три минуты после введения в клетки введите 100 микролитров люциферина ретроорбитально, используя инсулиновую иглу. Чередуйте глаз, используемый для инъекции, на каждом сеансе визуализации.

Подождав не менее двух минут, поместите до пяти мышей в биолюминесцентный тепловизор животных в положение лежачего на грудине и получите дорсальную картину с помощью настроек люминесценции. Под панелью управления отрегулируйте разрешение и настройки чувствительности, чтобы измерить люминесценцию ячеек. Для большинства приложений начните с трех минут, установите группирование на среднее, установите f/stop на единицу, установите поле зрения на d и установите высоту объекта на 1,5.

Если инъекция прошла успешно, сигнал обнаруживается в верхней части грудной клетки в одном легком или обоих легких. Если клетки сгруппированы у входа в трахею, то инъекция не увенчалась успехом. После получения дорсального изображения переверните мышей и получите вентральное изображение, а затем отрегулируйте настройку по мере необходимости.

После визуализации продолжайте послеоперационный уход, как описано в текстовом протоколе. Затем повторите этот протокол визуализации через три дня после приживления и еженедельно после этого. Для анализа изображений используйте программное обеспечение для анализа биолюминесценции.

Во-первых, загрузите все подходящие изображения в серии. Этот раздел подробно описан для одного программного пакета. Затем для каждой мыши на первом изображении серии создайте квадратную область интереса и расположите ее над верхней частью грудной клетки, охватывающей всю область легких.

Затем, щелкнув правой кнопкой мыши, откройте функцию копирования всех областей интереса и используйте этот инструмент, чтобы применить одни и те же области интереса к каждому изображению в группе. Затем на каждом изображении измените положение квадратов, чтобы они покрывали верхнюю часть груди каждой мыши. Проделайте это как для вентрального, так и для дорсального вида.

Теперь в левом верхнем углу окна изображения выберите функцию фотонов. Затем выберите вариант измерения. Затем данные из интересующих регионов отображаются в выходной таблице в виде общего потока.

При необходимости проанализируйте эти данные. При ослабленном иммунитете атимических мышей лечили блеомицином. До болюсного приживления клеток транзиторный фиброз наблюдался к 14-му дню у мышей, получавших блеомицин, но не у мышей, получавших носитель.

Затем клетки из установленной клеточной линии рака легких человека, H2030, были доставлены внутритрахеально в легкие этих мышей. Через 35 дней мыши, получавшие блеомицин, имели высокую нагрузку на легкие. Однако у животных, получавших лечение транспортными средствами, опухолей обнаружено не было.

Опухолевая нагрузка на легкие была подтверждена с помощью гистологии. В легких, предварительно обработанных носителем, не было признаков наличия опухолевых узелков, в то время как в легких, предварительно обработанных блеомицином, были большие опухолевые узелки. После трансплантации метастатической клеточной линии H2030 BrM 3, к 39-57 дням, биолюминесценция была слишком интенсивной для визуализации, поэтому метастазирование было проанализировано в отдаленных органах ex vivo.

Небольшие поражения могут быть обнаружены в различных тканях, что позволяет предположить, что этот метод является перспективным для изучения спонтанно диссеминированных заболеваний. После освоения эта техника может быть выполнена за 10 минут на клетку с пятью мышами без визуализации и за 20 минут на клетку при визуализации мышей. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости обеспечить правильное введение катетера и следить за дыханием животного.

После этой процедуры могут быть проведены другие методы, такие как фармакологические исследования или аминоуксусная химия собранной ткани, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как приживленные опухоли реагируют на лекарства или охарактеризовать остроумные стромальные взаимодействия, специфичные для легких. После его разработки этот метод может быть применен к различным линиям мышей и моделям опухолей, включая ксенотрансплантаты, полученные от пациента, в физиологически значимых условиях. Не забывайте, что работа с блеомицином может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как манипуляции в капюшоне с биологической опасностью и надлежащая утилизация.