Нейронной сети идентификация развивающих компетентным или некомпетентных мыши взрослой яйцеклеток

Общей целью этой процедуры является идентификация окцитов с обратной способностью к развитию с помощью неинвазивного инструмента. Основное преимущество этого метода заключается в том, что, просто наблюдая за движениями ооцитов, происходящими во время созревания in vitro, можно оценить потенциал развития женских гамет. Этот метод основан на покадровой визуализации в сочетании со скоростью изображения частиц, анализом на основе нейронных сетей.

Здесь мы опишем шаги, предпринятые для демонстрации того, что ооциты мышей во время перехода от зародышевой везикальной стадии к стадии метафазы 2 демонстрируют различный профиль указанных плазменных движений, в значительной степени коррелирующих с их компетентностью или некомпетентностью в развитии. По данным Всемирной организации здравоохранения, бесплодие – это патология, которая поражает около 20 процентов пар, и, кроме того, треть женщин, проходящих лечение рака, подвержены риску преждевременной недостаточности яичников. Это соответствует примерно 300 000 или 30 000 женщин в таких странах, как США или Италия соответственно.

Разработка неинвазивных процедур для определения компетентности развития ооцитов поможет улучшить общий успех исходов беременности. Здесь мы подробно описываем наиболее важные этапы процедуры, разработанной для мыши, чтобы сделать ее легко доступной для тестирования и использования на других видах млекопитающих, таких как крупный рогатый скот или человек. Яичники переносят в чашку Петри, содержащую предварительно нагретую и уравновешенную среду М2, температуру 37 градусов по Цельсию и пять процентов CO2.

Если яйцевод и некоторое количество жира все еще присутствуют вокруг яичника, их следует удалить. Затем, удерживая яичник пинцетом, его поверхность прокалывают с помощью стерильной иглы 1G. Проколотые яичники удаляются из среды М2 и с помощью ручной микропипетки переводятся в новую чистую среду М2, а затем пипетируются внутрь и наружу в течение нескольких секунд до тех пор, пока кучевые клетки, окружающие ооцит, не будут полностью удалены.

Далее ооциты переносят в каплях 20 микролитров среды М2 и если некоторые кумулюсные клетки сохраняются, их тщательно удаляют через несколько ходов от капли к капле до полного уничтожения кумулюсных клеток. Для того, чтобы приготовить Hoechst 33342 в конечной концентрации 0,05 мкг на мил, мы начинаем с мягкого раствора Hoechst в концентрации пять миллиграмм на миль и разбавляем его далее до получения требуемой концентрации. 3,5 микролитра раствора Хёхста помещают на дно крышки чашки Петри, а затем каждый отдельный разведенный ооцит переносят в одну каплю Хёхста, стараясь уменьшить воздействие света в процессе окрашивания Хёхста, накрывая чашку темной крышкой.

После десятиминутного окрашивания ооциты наблюдаются под флуоресцентным микроскопом с ультрафиолетовым излучением. Основываясь на конформации хроматина, они классифицируются либо как Surrounded Nucleolus, SN, если они представляют кольцо X-положительного хроматина вокруг ядрышка, либо как Not-Surrounded Nucleolus, NSN, если в ядрышке отсутствует кольцо x-положительного хроматина и общий хроматин диспергирован в ядрышке. Четыре двухмикролитровые капли среды альфа-мем наносят на чашку Петри со стеклянным дном, стараясь держать капли на определенном расстоянии, капли накладывают на предварительно подогретое и приравненное минеральное масло, и всего на каждую каплю переносят три-четыре ооцита.

Чашка Петри помещается в инкубационную камеру покадрового микроскопа, что позволяет при длительном циклировании поддерживать температуру на уровне 37 градусов по Цельсию и пяти процентов CO2 и освещать ее красным светодиодным светом. Перед покадровым анализом с помощью программного обеспечения BioStation устанавливаются координаты каждой капли, чтобы автоматизировать переход от одной капли к другой во время процедуры покадровой съемки. Интервальная съемка кадров делается с восьмиминутными интервалами в общей сложности 15 часов.

Записанные видеоролики затем анализируются с помощью программного обеспечения CellPave, которое позволяет обнаруживать движения цитоплазмы, выраженные в терминах векторов скорости. Во-первых, с помощью инструмента CellPave периметр каждой ооциты определяется вручную. Затем программное обеспечение вычисляет скорость цитоплазматического движения, происходящую при сравнении двух последовательных покадровых кадров, и выражает ее с помощью цветной стрелки, интенсивность и длина которой определяет скорость и направление движений.

Гистограмма под ооцитом, показанная здесь, описывает общую скорость движения цитоплазмы в течение 15-часового периода регистрации SN-ооцита. Такой же анализ проводится и на ооците NSN. Обратите внимание на отсроченный пик экструзии полярного тельца, показанный ооцитом NSN по сравнению с ооцитом SN.

В нижней части экрана отображается временная картина скорости цитоплазматического движения ооцита. Скорость рассчитывается путем сравнения двух последовательных кадров. Необработанные данные о скорости движения цитоплазмы затем экспортируются в таблицу Excel, где по строкам — последовательность Френса, а по столбцам — анализируется один ооцит

С левой стороны — данные SN-ооцита, а с правой — данные NSN-ооцитов. Данные ооцитов SN или NSN затем разбиваются на 10 подгрупп. Девять используются для тренировок, зеленого цвета.

И один для слепого тестирования, красного цвета. Эту процедуру повторяют в общей сложности 10 раз. Каждый раз меняя слепой тестовый образец.

Затем данные исследуются с помощью искусственной нейронной сети с прямой связью, или FANN. FANN создан для анализа всех кадров покадровой съемки, здесь называемых входными нейронами: «Последние связаны с тремя скрытыми нейронами, которые в свою очередь связаны с двумя выходными нейронами. Один выход дает вероятность того, что входом является компетентный ооцит.

Другой, наоборот, что входом является некомпетентный ооцит. Сравнение двух выходных данных предсказывает умственную компетентность дула ооцитов с точностью до 91,03 процента. Методика была настроена на яйцеклетки мыши, как показано здесь.

Тем не менее, в будущем мы будем тестировать его на человеческих ооцитах. На самом деле, что неинвазивные процедуры из анализа качества ооцитов особенно востребованы в области искусственных репродуктивных технологий.