Изучая диабет глазами рыбы: Microdissection, визуализации и анализа взрослых tg(fli:EGFP) сетчатки сосудистую данио рерио

Общая цель этого протокола вскрытия сосудистой сети сетчатки у взрослых рыбок данио — обеспечить быстрое считывание долгосрочных сосудистых патологий, связанных с неоангиогенезом и структурными изменениями, с помощью флуоресценции или лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микрососудистых осложнений, таких как развитие диабетической ретинопатии. Основное преимущество этой методики заключается в том, что вся ретиноскулятура может быть представлена и проанализирована в физиологических и патологических процессах без применения межсосудистой флуоресценции относительно быстрым и стандартизированным способом.

Для начала перелейте шесть миллилитров свежеприготовленного четырехпроцентного раствора PFA PBS на пробу в лунки шести луночных планшетов. После усыпления взрослых рыбок данио согласно текстовому протоколу, поместите их на свежие бумажные полотенца и обсушите. С помощью скальпеля разрежьте головки за оперкулумом.

Затем переложите головки прямо в лунки со свежеприготовленным фиксатором. Храните пластины с рыбьими головами при температуре четыре градуса Цельсия не менее 24 часов, чтобы фиксатор проник в более глубокие слои сетчатки. Разогретой двухпроцентной агарозой заполните чашку Петри на треть и подождите, пока агар станет твердым.

Накройте агаровую пластину одним X PBS, чтобы создать рабочее пространство для препарирования глаз. Переложите зафиксированный образец в чашку Петри. И, придерживая головку у поверхности среза одним пинцетом, вставить другой, скрепленный пинцетом ниже глазного яблока в орбитальной полости.

Медленно откройте пинцет под глазом и возьмитесь за зрительный нерв. Затем осторожно оторвите и отсоедините глаз. Чтобы удалить любую из четырех прямых и две косые экстраокулярные мышцы, соединенные с глазом, а также остаточную экстраокулярную ткань, соединяющую глаз с орбитальной полостью, удерживайте глаз через полузакрытый пинцет и, захватывая конструкцию другим пинцетом, используйте диаметральные движения, чтобы мягко оторвать ее.

Затем используйте одноразовую иглу 27 калибра, чтобы проколоть роговицу на внешнем пределе. Через это отверстие используйте оба пинцета, чтобы удерживать роговицу и слегка разорвите ее. Затем осторожно поработайте, чтобы создать разрыв по центру размером с соответствующий зрачок.

Надавите на роговичную сторону глазного яблока по внешнему краю роговицы над радужной оболочкой. Это создаст небольшую вмятину и подтолкнет линзу на высоту разрыва роговицы. Затем проведите пинцетом под линзу и снимите ее.

Затем переверните глаз вверх ногами зрительным нервом вверх. Обратите внимание, что склера и роговица соединены и образуют фиброзную оболочку глазной луковицы для защиты чашеобразной сетчатки. Эта оболочка, называемая корнеосклерой, щадит область вокруг зрительного нерва.

Вставьте иглу в это отделение, чтобы создать отверстие между склерой и сетчаткой. Затем, используя этот доступ обоими пинцетами, осторожно разорвите склеру в осевом направлении на полоски, чтобы увеличить отверстие вокруг зрительного нерва. Будьте осторожны, чтобы сохранить корнеосклеру в целости и сохранности при переходе к боковой окружности роговицы.

Прежде чем удалить корнеосклеру из оставшейся внутриглазной ткани, постарайтесь разорвать любые соединения, так как прикрепление к другим структурам будет критическим моментом. Затем удерживайте склеру одним пинцетом и, захватив другим зрительный нерв и оттягивая, полностью удалите корнеосклеру из глаза и выбросьте ее. На этом этапе будет создана чашеобразная структура, состоящая из язычковой оболочки и сетчатки, содержащих сосудистую сеть сетчатки.

Затем создайте разрыв в слое хориоидеи и РПЭ, держа иглу 27 калибра боком к оставшейся чашке, одновременно соскребая внешнюю поверхность ободком кончика иглы. Используйте разрыв в качестве точки доступа, чтобы захватить слой сосудистой оболочки и RPE, и используйте оба пинцета, чтобы разорвать его на полосы, сохраняя соединение с радужной оболочкой неповрежденным. После этого пропустите один пинцет под радужную оболочку и перемещайте его по кругу снаружи, создавая напряжение, потянув за прекращенный слой хориоидеи и РПЭ, и отсоедините объединенную структуру.

Если части радужной оболочки не могут быть удалены и остаются соединенными с чашеобразной сетчаткой после удаления сосудистого и RPE-слоя, используйте еще одну естественную точку разрыва, которую глаз взрослой рыбки данио-рерио проявляется внутри фоторецепторного слоя. Подобным образом как раз демонстрируется удаление радужной оболочки. Соскребите оставшуюся чашеобразную сетчатку, чтобы вызвать прекращение в слое фоторецептора.

Затем используйте созданный доступ, чтобы удалить слой, сохранив при этом возможное соединение с радужной оболочкой. После этого пропустите пинцет под радужную оболочку глаза и продолжайте движение по кругу, как показано ранее в этом видео, чтобы отсоединить объединенную структуру. Очень важно разумно отсоединить радужную оболочку от подлежащей ткани, так как это будет блокировать флуоресценцию непосредственно над внутренним оптическим кругом во время визуализации сосудов.

Слишком прямой подход может привести к поломке судна. Затем с помощью пружинных ножниц для микродиссекции с прямой режущей кромкой два целых пять миллиметров, чтобы разрезать зрительный нерв как можно ближе к сетчатке. Это позволит обеспечить более качественное плоское крепление ткани.

Чтобы установить и визуализировать сосудистую сеть сетчатки, используйте одну X PBS для промывания рассеченной сетчатки два раза по пять минут каждый. Поместите каплю PBS на предметное стекло. Затем с помощью лабораторного шпателя с концом микроложки перенесите сетчатку в каплю.

С помощью пинцета удерживайте ткань на месте, в то время как с помощью скальпеля разрежьте чашеобразную структуру, чтобы создать плоскую форму с четырьмя или пятью лепестками, в зависимости от размера сетчатки. С помощью тонкого листа бумаги высосите оставшуюся часть над PBS, стараясь не задеть сетчатку глаза. Затем покройте плоскую сетчатку монтажным материалом и накройте ее покровным стеклом.

Будьте внимательны, чтобы не образовалась пена, так как пузырьки воздуха могут исказить визуализацию сосудов сетчатки. Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать крышку. Наконец, проведите флуоресцентную или лазерную сканирующую микроскопию для визуализации сосудистой сети сетчатки.

Здесь показан морфологический пример сосудистой сети сетчатки у взрослых трансгенных мух данио-рерио EGFP, визуализированный с помощью флуоресцентного микроскопа, и второй пример, визуализированный с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, который уменьшает фоновую флуоресценцию. Выявленная структура сетчатки демонстрирует высокоорганизованный рисунок. Зрительная артерия проникает в сетчатку в точке диска зрительного нерва и в большинстве образцов распространяется на пять-семь основных сосудов.

Затем основные сосуды разветвляются на последовательность аркад и соединяются с внутренним оптическим кругом или МОК, также называемым окружной веной, опоясывающей зрительный диск на периферии плоской сетчатки. Сетчатка глаза взрослой рыбки данио состоит из следующих слоев изнутри наружу. Слой ганглиозных клеток, внутренний плексиформный слой, внутренний ядерный слой, внешний плексиформный слой, внешний ядерный слой, фоторецепторный слой и пигментный эпителий сетчатки.

Приведена оценка параметров сосудистой сети по визуализации сосудистой сети сетчатки. Внутренняя сосудистая сеть сетчатки расположена на слое ганглиозных клеток, в то время как сердечные капилляры связаны с пигментным эпителием сетчатки. После обучения эту технику можно выполнить менее чем за 20 минут, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать регулярно практиковаться, так как длительное отсутствие на подготовке снижает целостность сосуда. После этой процедуры можно проанализировать диабет и нейроваскулярные патологии у взрослых рыбок данио.