Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Общая цель этого эксперимента заключается в детектировании фосфорилирования Rab10 LRRK2 с помощью SDS-PAGE с меткой, связывающей фосфат. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований болезни Паркинсона, такие как то, как мутации в LRRK2 влияют на фосфорилирование Rab10. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно получить грубую оценку стехиометрии фосфорилирования Rab10 с помощью простого вестерн-блота.

Многие шаги этого протокола довольно стандартны и достаточно подробно описаны в текстовом протоколе, прилагаемом к этому видео. Здесь мы хотим показать вам шаги, которые больше всего выигрывают от визуальных инструкций. Подготовьте планшеты с трансфицированными клетками HEK293, как описано в текстовом протоколе.

Положив пластины на лед, отсадите и выбросьте среду. Затем осторожно добавьте два миллилитра DPBS в угол каждой пластины и раскачивайте пластины, чтобы распределить раствор. Затем извлеките и выбросьте DPBS.

Далее в каждую пластину добавляют по 100 микролитров лизисного буфера. Наклоните пластину и с помощью скребка распределите буфер и выпустите лизат клеток. Затем отсадите лизаты и перенесите их в предварительно охлажденные на льду микропробирки и подождите 10 минут.

Затем соберите безмусорные клеточные лизаты, центрифугируя пробирки и перенося надосадочную жидкость в новые пробирки на льду. Затем измерьте концентрацию белка очищенных лизатов с помощью анализа Брэдфорда. Для получения данных о концентрации подготовьте 100 микролитровых образцов лизатов для анализа геля.

Приготовьте более плотные лизаты для измерения эндогенного Rab10 по сравнению с гиперэкспрессией гемагглютинина Rab10. Завершите подготовку образцов, инкубировав их при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем храните образцы при температуре ниже минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся, в течение шести месяцев или дольше.

Для начала подготовьте ячейки SDS-PAGE в соответствии с текстовым протоколом. Затем загрузите гель в бак и закрепите его связующими зажимами. Далее наполните бак проточным буфером и удалите пузырьки воздуха в лунках и под гелем с помощью иглы, прикрепленной к шприцу.

Теперь добавьте хлорид марганца в образцы и открутите их, чтобы удалить осадки. Затем загрузите в гель равные объемы образца, 10 мкг белка для анализа сверхэкспрессированного гемагглютинина Rab10 или 30 мкг белка для анализа эндогенного Rab10. Загрузите пустые дорожки буфером для проб, содержащим хлорид марганца.

Также дополните маркер молекулярной массы буфером и хлоридом марганца, чтобы он был того же объема, что и образцы. Теперь начните запускать гель при напряжении 50 вольт. После укладки образцов увеличьте напряжение до 120, чтобы получить разделение.

Когда фронт красителя достигнет дна гелей, убьет напряжение. Далее смойте гель три раза следующим образом. Загрузите разделительный гель в ванну с чистым буфером для переноса с добавлением ЭДТА и SDS.

Затем дайте ему покачаться на шейкере в течение 10 минут при комнатной температуре. После трех стирок выполните еще одну промывку с использованием буфера для переноса с добавлением SDS, но без ЭДТА. Затем перенесите гель с помощью влажной емкости.

Загрузите бак в пенопластовый ящик, наполненный ледяной водой, подключите бак к источнику питания и начните перекачку. Длительная пересадка с эффективным охлаждением имеет важное значение для процедуры. После переноса проверьте перенос, окрашивая мембрану Ponceau S, с последующей промывкой в TBST в соответствии с текстовым протоколом.

Далее применяем блок. Погрузите кляксу в молочный TBST и покачивайте кляксу на шейкере в течение часа при комнатной температуре. Затем удалите и выбросьте блокирующий раствор и нанесите первичный раствор антитела.

Теперь покачиваем мембрану на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день удалите первичный раствор антитела. Затем промойте мембрану свежим TBST три раза, как и раньше.

После промываний погрузите блотку во вторичный раствор антител и инкубируйте мембрану на коромысле около часа при комнатной температуре. После инкубации промывайте мембрану с TBST три раза еще раз. Теперь разработайте мембрану.

Добавьте один миллилитр раствора ECL на большой лист полиэтиленовой пленки. Затем поместите мембрану в ECL и быстро переверните ее, чтобы намочить обе стороны. Далее поднимите мембрану и дайте ей стечь.

После слива дайте одному краю коснуться бумажного полотенца в течение примерно пяти секунд, чтобы помочь отводить излишки раствора. Затем оберните мембрану в жесткую прозрачную пленку без складок и переложите ее в черный лоток для визуализации. Клетки HEK293 трансфицировали гемагглютинином Rab10 дикого типа и 3xFLAG-LRRK2.

Были протестированы киназы дикого типа, неактивные в семейных мутациях LRRK2 при болезни Паркинсона. Ко-сверхэкспрессия LRRK2 и Rab10 привела к значительному сдвигу полосы в геле P-tag. Напротив, коэкспрессия с неактивным мутантом киназы не приводила к изменению подвижности Rab10, что указывает на то, что киназа является причиной сдвига полосы.

Кроме того, как и ожидалось, все семейные мутации БП увеличивали сдвиг полосы. Гелевая система P-tag также использовалась для анализа эмбриональных клеток фибробластов 3T3-швейцарского альбиноса мыши, обработанных ингибитором LRRK2. Сдвиг полосы, соответствующий фосфорилированному эндогенному Rab10, исчезал при обработке клеток GSK2578215A.

Такой же тест был проведен с использованием человеческих клеток A549. В этих экспериментах эффективность ингибитора LRRK2 была подтверждена с использованием анти-p серинового антитела 935 LRRK2, которое является хорошо известным маркером ингибирования LRRK2. После освоения этой техники требуется всего 14 дополнительных минут по сравнению с обычной процедурой вестерн-блоттинга, которая предназначена для умывания гелями перед переносом.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как масс-спектрометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, фосфорилируют ли мутанты FPD тот же остаток Rab10. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области исследований Паркинсона к изучению эндогенных уровней фосфорилирования Rab10 в культивируемых клетках, а также в тканях. Не забывайте, что работа с микроцистином, добавленным в буфер для лизиса, может быть чрезвычайно опасной, и при приготовлении клеточных лизатов всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты.