Протокол для слежения в реальном времени 3D одной частицы

Общая цель этого протокола заключается в создании 3D-микроскопа для слежения за отдельными частицами в режиме реального времени. Основное преимущество этого метода заключается в том, что один диффундирующий наномасштабный объект может контролироваться непрерывно с ограниченным по времени разрешением фотонов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области вирусологии, такие как отслеживание одного вириона на протяжении всего процесса заражения.

Подготовьте аппарат на оптическом столе. Эта конфигурация готова к калибровке. Ключевые компоненты включают в себя твердотельный лазер с яркостью 488 нанометров, два электрооптических дефлектора, которые расположены вдоль пути луча, настраиваемую акустическую градиентную линзу и предметный столик с микро- и нанопозиционерами.

Эта схема настройки содержит дополнительные сведения. Вот траектория лазерного луча до предметного столика образца. Электрооптические дефлекторы и перестраиваемая акустическая линза расположены вдоль траектории луча.

Эти устройства динамически управляют лазерным пятном на стадии образца. Фотоны из образца подсчитываются лавинным фотодиодом. Камера следит за положением частицы.

Положение образца задается с помощью микро- и наноконтроллеров. Программируемая пользователем вентильная матрица управляет лазерным пятном, расчетом положения частиц в реальном времени, обратной связью по столу и подсчетом фотонов. Необходимо подготовить два образца.

Для первого, требуются 190 нанометровые флуоресцентные шарики, разведенные в фосфатно-солевом буфере. Используйте защитный лист для подготовки неподвижного образца частиц. Нанесите 400 микролитров раствора шариков на покровное стекло.

Теперь получите образец свободно движущихся частиц. Для этого требуются 110 нанометровые флуоресцентные шарики, разведенные в воде. Создайте свободно движущийся образец частиц, поместив 400 микролитров раствора на покровную крышку.

Возьмите образец неподвижной частицы в микроскоп для установки. Образец находится на нанопозиционере XY. Включите лазер, фотоприемник, контроллеры для элементов линии луча и для позиционеров.

Запускайте позиционер Piezo nano в замкнутом контуре. Далее снимите фильтр флуоресцентного излучения с передней части фотодетектора. Затем измените z-положение образца с помощью микропозиционера.

Если положение меняется, используйте фотодетектор для контроля интенсивности отражения лазера. Увеличьте интенсивность, чтобы определить фокальную плоскость линзы объектива. Когда образец находится в фокальной плоскости, замените фильтр флуоресцентного излучения.

Теперь работайте с программным обеспечением для управления компьютером. Используйте специальное программное обеспечение для растрового сканирования образца. Для начала установите большой диапазон сканирования, разницу между началом и финишем.

Здесь диапазон составляет 10 микрометров по Y и 10 микрометров по X. Кроме того, установите большой размер шага в каждом направлении. Здесь 200 нанометров. Установите оба поля Z в ранее определенное положение фокальной плоскости.

Нажатие кнопки сканирования запустит сканирование растра. Запустите сканирование. Программное обеспечение приводит в действие электрооптические дефлекторы во время ночного тура, собирает данные с фотодетектора, управляет нанопозиционером и выполняет расчет положения.

Сканирование найдет частицу, которую можно идентифицировать в программном обеспечении с помощью платной флуоресценции. Для каждого участка сканирования программное обеспечение также определит оценки положения частиц в X и Y относительно центра сканирования дефлектора электрообъекта. После обнаружения частицы уменьшите диапазон сканирования вокруг нее до двух микрометров по X и Y. Кроме того, уменьшите размер шага для обоих до 100 нанометров.

Добавьте диапазон сканирования в направлении Z на два микрометра, чтобы зафиксировать флуоресцентный фокус. Установите размер шага Z на 200 нанометров. Запустите 3D-сканирование растра, чтобы найти флуоресцентный фокус.

Данные, полученные в результате сканирования, показывают фокальную плоскость до включения перестраиваемого акустического градиентного объектива. Перейдем к работе с настраиваемой настройкой акустической линзы в управляющем программном обеспечении. Сначала нажмите «Подключить», затем включите питание.

Перейдите в раздел управления импульсами и стробированием, измените режим запуска выходного сигнала с RGB на многоплоскостной. Затем измените его обратно на RGB, чтобы можно было изменять фазу вывода. С помощью ползунков установите фазу вывода в диапазоне от нуля градусов, 90 градусов до 270 градусов.

Далее переходим в раздел управления частотой. Там выберите резонансную частоту 68, 500 герц. Перейдите в верхнюю часть экрана и нажмите «Дополнительно».

Затем выберите вкладку настроек. На новом экране найдите максимальную частоту нулевого столбца. Настройте его, чтобы изменить диапазон поиска частоты.

Нажмите, сохраните калибровку, затем выйдите из калибровки. Вернитесь к регуляторам частоты и измените резонансную частоту. Немедленно измените его обратно на 68 500 Гц, чтобы калибровка вступила в силу.

В разделе управления амплитудой с помощью ползунка медленно поднимайте амплитуду до 35%После этого нажмите заблокировать резонанс. Когда частота заблокирована, нажмите кнопку «Разблокировать резонанс». Вернитесь к программному обеспечению для сканирования растров.

Входные данные с двумя микрометрическими диапазонами сканирования с центром в точках X и Y. Используйте шаг 100 нанометров. Центр частицы в диапазоне четырех микрометров по оси Z, с шагом 200 нанометров. На полученном в результате сканирования изображении область освещения, представляющая частицу, имеет ширину около одного микрометра.

Исходя из этого, отрегулируйте параметр шкалы XY так, чтобы предполагаемые положения в X и Y варьировались от отрицательных 0,5 до 0,5 микрометров. После аналогичной процедуры со шкалой Z установите нанопозиционер в нулевое положение. Выключите питание нанопозиционера, прежде чем продолжить.

Замените неподвижный образец частиц свободно движущимся образцом частиц. Затем убедитесь, что все оборудование включено. Запустите позиционер Piezo nano в разомкнутом контуре.

На компьютере установите программное обеспечение для настройки акустического градиента объектива, как и раньше. Снимите фильтр флуоресцентного излучения с пути к фотоприемнику. Найдите фокальную плоскость, изменяя положение образца по оси Z и максимизируя интенсивность отражения лазера от покровного стекла.

После нахождения фокальной плоскости увеличьте положение фокусировки на 15 микрометров в раствор. Замените фильтр флуоресцентного излучения. Откройте пользовательское программное обеспечение для отслеживания.

Установите параметры оценки позиции на значения, найденные при оптимизации. Теперь установите интегральные константы управления, которые определяют скорость отклика нанопозиционера. Начните с константы X.

Введите низкое значение и медленно увеличивайте его. Когда в считывании положения частицы начинаются колебания, обратите внимание на значение управляющей константы. Уменьшите интегральную управляющую константу примерно до 70% от ее значения в начале колебаний.

Повторите шаги с управляющими константами Y и Z. Установите триггер для начала слежения за порогом трека на три килогерца. Установите минимальную частоту слежения, от триггера до окончания слежения, на частоте 1,5 килогерца.

Чтобы запустить эксперимент, нажмите кнопку Поиск, а затем нажмите кнопку Автоматическое отслеживание. В этом фильме показан результат использования трехмерного микроскопа с отслеживанием динамической локализации фотонов для отслеживания диффузионного движения флуоресцентной наночастицы размером 110 нанометров в воде. Положение частицы, измеренное с помощью считывания положения нанопозиционером, отображается на 3D-осях.

Врезка представляет собой считывание данных научной камеры морского мха. Он демонстрирует, что частица удерживается, зафиксированной в фокусном объеме, системой слежения. Частица отслеживалась, и ее положение регистрировалось в течение более двух минут.

После освоения этот метод может быть выполнен менее чем за 50 минут, если система правильно настроена и установлены параметры калибровки. После его разработки эта методика поможет исследователям в области доставки лекарств исследовать пути интернализации и транспортировки клеточных грузов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как работать с 3D-микроскопом слежения за отдельными частицами с нулевым временем.