Визуализация биопленки в Candida albicans с помощью автоматизированных Microfluidic устройства

Общая цель этого протокола заключается в визуализации образования биопленки Candida albicans в режиме реального времени в физиологических условиях хозяина. Этот метод позволяет наблюдать за образованием биопленки по мере ее развития в режиме реального времени и может быть использован для проверки эффективности противомикробных препаратов или для оценки генетических мутантов. Этот метод может быть использован для скрининга потенциальных терапевтических средств на активность в отношении биопленок с высокой пропускной способностью, а их эффективность может быть измерена, визуализирована и сравнена с существующими методами лечения.

Основное преимущество данной методики заключается в том, что с ее помощью можно анализировать образование биопленки в нескольких различных условиях, представляющих интерес для исследователей. Хотя этот метод был разработан специально для изучения образования биопленки Candida albicans, он также может быть применен к другим микроорганизмам, образующим биопленку, включая другие виды грибов, а также бактерии. Для начала приготовьте одиночные культуры колоний различных штаммов C.albicans из клеток, покрытых пептон-декстрозой дрожжевого экстракта или средним агаром YPD в соответствии со стандартной микробиологической практикой.

Затем включите микрофлюидную систему, которая включает в себя контроллер, два блока питания, микроскоп, камеру и компьютер, подключенные к системе. Как только компьютер загрузится, откройте программное обеспечение, управляющее системой. Найдите номер штрих-кода используемой пластины и введите его по запросу программного обеспечения.

Затем в модуле управления установите температуру микрофлюидной системы на уровне 37 градусов Цельсия. Затем нажмите на входные отверстия I1, I7, I13 и I19 и продуйте стерильный воздух через трубки интерфейсной пластины в течение пяти минут, чтобы удалить конденсат. Когда весь конденсат испарится, поместите 48-луночный микрофлюидный планшет 0-20 dyne на предметный столик микроскопа.

Для 12-часового эксперимента по образованию биопленки начните с добавления 600 микролитров предварительно подогретой среды во входные лунки. Медленно опустите очищенную интерфейсную пластину на верхнюю часть 48-луночной микрофлюидной пластины. Затем сдвиньте интерфейсную пластину немного влево, пока трубки не окажутся на вершине входного и выпускного отверстий и не зафиксируются на месте.

В разделе программного обеспечения «Контроль сдвига» установите режим потока на постоянный, а максимальный сдвиг — на одну дину на квадратный сантиметр. Затем нажмите на входные колодцы с фильтрующим материалом, чтобы начать подачу фильтрующего материала из входного в выпускной колодец с целью заправки канала. После пяти минут потока нажмите на кнопку «Стоп» в разделе управления скважинной пластиной программного обеспечения.

Затем снимите интерфейсную пластину и осмотрите микрофлюидные лунки пластины. В выходных лунках должна быть видна лишь небольшая капля среды. Чтобы протестировать штаммы дикого типа и мутантные C.albicans, добавьте 50 микролитров клеточной культуры дикого типа SC5314 в паутинной среде в две выходные лунки, добавьте мутант bcr1 в паутинной среде в две выходные лунки и добавьте мутант EFG1 в паутинной среде в две выходные лунки.

Поместите интерфейсную пластину обратно на микрофлюидную пластину и зафиксируйте крышку на месте. Вернитесь в раздел программного обеспечения, посвященный контролю сдвига, установите режим потока в постоянное положение и установите максимальный сдвиг на уровне двух дин на квадратный сантиметр. Кликните по выходным лункам с ячейками, чтобы начать подачу среды из выходного отверстия во входные лунки, чтобы начать посев C.albicans.

Через три секунды нажмите кнопку «Стоп» в разделе управления скважинной пластиной, чтобы предотвратить попадание ячеек во входные лунки. Дайте клеткам оставаться неподвижными без потока в течение 10-20 минут в смотровом канале для первоначального адгезии клеток. В окне модуля обработки изображений откройте модуль многомерного сбора данных и перейдите на вкладку «Область» в меню слева.

В разделе «Стадия» загрузите список основных стадий для 48-луночного микрофлюидного планшета 0-20 dyne. Далее откройте регулировку перезагрузки образца и переместите столик в абсолютное положение модулей. В модуле настройки перезагрузки образца нажмите кнопку реального времени, чтобы увидеть предварительный просмотр изображения с перекрестием.

С помощью джойстика расположите пластину лунки так, чтобы кончик стрелки, расположенный рядом с четвертым каналом просмотра, совпал с перекрестием на программном обеспечении. Затем перейдите в меню перехода этапа в абсолютное положение и нажмите кнопку «Установить начало координат». Затем вернитесь к модулю регулировки перезагрузки образца, нажмите на раздел начальной точки отсчета в левом меню и загрузите файл для 48-луночного микрофлюидного планшета 0-20 dyne.

В разделе предметного столика модуля многомерного сбора данных дважды щелкните по положению предметного столика 22.2, чтобы приблизить предметный столик микроскопа и фокус камеры к маркеру стрелки по каналу обзора 22. Затем с помощью джойстика расположите пластину колодца таким образом, чтобы кончик стрелки, примыкающий к смотровому каналу 22, совпал с перекрестием. Скопируйте координату Y в модуле многомерного сбора данных в положение Y.

2 на вкладке «Обновить опорные точки» модуля регулировки перезагрузки образца. Наконец, на вкладке «Обновление позиций стадий» модуля настройки примера перезагрузки нажмите «Применить к списку стадий MDA». В окне модуля обработки изображений используйте модуль многомерного сбора данных и нажмите на вкладку «Сохранить» в меню слева.

Затем выберите имя файла для эксперимента и папку для хранения полученных изображений на компьютере. Затем нажмите на вкладку «Таймлапс» и настройте ее на получение 145 изображений в общей сложности через пять минут между каждым изображением. Затем во вкладке «Длины волн» установите количество длин волн равным одной и снимайте на 50% Brightfield и 50% камеры с временем экспозиции 12-20 миллисекунд.

Установите коэффициент усиления на 0,6, а дигитайзер на 20 миллигерц. После установки фокуса, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, выберите «Получить», чтобы начать захват изображений прикрепленных ячеек до сброса для всех подэтапов. В разделе контроля сдвига установите режим потока на постоянный, а максимальный сдвиг на одну дину на квадратный сантиметр.

Затем нажмите на входные лунки, чтобы начать поток среды от входных к выходным лункам, чтобы удалить все неприлипшие ячейки. Через пять минут нажмите на кнопку «Стоп» в разделе управления скважинной пластиной. Подождите второй раунд получения изображений, а затем в разделе контроля сдвига отрегулируйте максимальный сдвиговый поток до 0,5 дины на квадратный сантиметр и подтвердите изменение.

В окне модуля обработки изображений выберите вкладку «Инструменты анализа» и нажмите «Просмотреть многомерные данные» в выпадающем меню. Затем нажмите на выбор базового файла. После этого откроется окно утилит многомерного набора данных.

Далее нажмите на кнопку выбора каталога и выберите папку, из которой был сохранен эксперимент. В списке наборов данных выберите журнал файла эксперимента. Как только журнал загрузится, нажмите на кнопку просмотра.

Выберите длину волны, нажав на опции в меню длин волн слева, и выберите положение сцены для просмотра из выпадающего меню. Выберите изображение для загрузки из чисел в верхней части модуля, щелкнув правой кнопкой мыши по номеру изображения. Затем выберите все изображения, чтобы сделать таймлапс-видео.

Выбранные изображения откроются в виде видео в новом окне. Нажмите на вкладку «Файл» в окне модуля обработки изображений и выберите «Сохранить как» в выпадающем меню. Сохраните полученное видео в формате файла по умолчанию.

Наконец, откройте и загрузите сохраненный видеофайл в изображение J.In изображение J, нажмите на вкладку «Файл», а затем нажмите «Сохранить как». Выберите AVI в раскрывающемся меню и преобразуйте файл в файл AVI, используя преобразование JPEG, установленное на 10 кадров в секунду. В условиях дикого типа в средах RPMI 1640 несколько ячеек сильно прилипли к каналу.

Они образуют гифы, и можно наблюдать толстую биопленку с интеркалирующими гифами и дрожжевыми клетками. К концу микрофлюидного эксперимента биопленка дикого типа полностью заполняет этот канал просмотра. Присутствие амфотерицина В, однако, оказывает выраженное влияние на снижение образования биопленки.

В частности, адгезия ячеек уменьшается, и можно увидеть, как некоторые ячейки утекают вместе со сдвиговым потоком среды. Контрольные клетки дикого типа, на этот раз выращенные в паучьей среде, образовали биопленку, похожую на ту, которая только что была показана при выращивании в RPMI. Также в этой среде выращивают двух мутантов с дефектами биопленки.

Оба штамма демонстрируют значительно сниженное образование биопленки по сравнению с контролем. В этой клеточной популяции адгезивные клетки не образуют гиф, и образовавшаяся биопленка является сильно дефектной. Этот другой штамм имеет дефекты как в образовании биопленки, так и в способности прилипать к каналу.

После освоения этот эксперимент может быть поставлен менее чем за час. Используя этот метод, можно многое узнать о различных аспектах образования биопленки, включая первоначальную адгезию клеток, созревание биопленки и рассеивание клеток. Этот протокол обладает широкими возможностями настройки и универсален.

Он может быть скорректирован для оценки различных видов микроорганизмов в разных царствах. Скорость потока, температура, время инкубации и среда также могут быть использованы для изучения биопленок смешанных видов. Мы настоятельно рекомендуем этот микрофлюидный биопленочный анализ в качестве анализа in vitro, который следует использовать перед испытаниями на животных in vivo.

По нашему опыту, результаты этого анализа очень хорошо коррелируют с существующими биопленочными анализами in vivo.