Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Общая цель этой экспериментальной установки состоит в том, чтобы очертить основные слои регуляции РНК и ДНК для раскрытия основных молекулярных механизмов, возникающих в ответ на стимул или лечение. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы во многих различных биологических областях, таких как иммунные реакции в целом, а также молекулярные реакции на медикаментозное лечение. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет одновременно отображать несколько слоев регуляции генов с течением времени.

Поэтому важно использовать один и тот же пул ячеек для каждого метода. В общих чертах, эти три протокола включают в себя сначала манипулирование интересующими нас клетками в различные временные точки. После каждой манипуляции клетки объединяются и разделяются на три группы, по одной для каждого анализа.

В этом разделе видео описывается маркировка и очистка самых последних полученных транскриптов с помощью 4sU-мечения. Каждый протокол в конечном итоге производит образцы, готовые к секвенированию. Во-первых, проверьте требуемую концентрацию 4sU и время инкубации, необходимое для интересующей клеточной линии.

Например, 200 микромоляров 4sU используется на Т-клетках в течение одного часа. Разделите пул клеток после обработки в одну отдельную чашку для каждого метода и момента времени. Затем полностью разморозьте необходимое количество аликвот 4sU, добавьте 4sU непосредственно в клеточную среду и инкубируйте культуры в соответствии с указаниями.

Затем соберите меченые 4sU ячейки в полипропиленовые пробирки. Затем центрифугируйте клетки. Ресуспендируйте гранулу в ТРИЗОЛе в концентрации около трех миллионов клеток на миллилитр и инкубируйте клетки в ТРИЗОЛЕ при комнатной температуре в течение пяти минут.

Теперь приготовьте от 30 до 80 микрограммов РНК или больше, используя метод Радла и компании. Далее смешайте реакцию биотинилирования тиол-специфичной в указанном порядке. Начните с воды, не содержащей нуклеаз, затем с 10-кратного буфера, затем с РНК и в последнюю очередь с биотин-HPDP.

Затем смешайте с помощью пипетки и инкубируйте. Перейдите к этапу очистки, чтобы получить образцы только что транскрибируемой биотинилированной РНК, смешанной с немеченой, ранее существовавшей РНК. Далее нагрейте образцы до 65 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Затем сразу же положите их на лед. Как только каждый образец остынет, добавьте 100 микролитров шариков стрептавидина и инкубируйте их при комнатной температуре с вращением в течение 15 минут. Теперь изолируйте бусины, украшенные только что транскрибированной РНК, с помощью магнитной колонки, а затем разбавьте РНК в 11 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз, для последовательности.

В этом разделе описывается, как изолировать РНК, которые активно транслируются. Секвенирование этих транскриптов исследует динамическую транслатосому. В сочетании с данными секвенирования РНК этот анализ позволяет рассчитать оборот РНК и скорость трансляции.

Начните с добавления циклогексимида в суспензию и перемешивания с помощью инверсий. Через одну минуту при комнатной температуре центрифугируйте клетки, удалите среду и промойте клетки не менее чем 10 миллилитрами PBS с добавлением циклогексимида. Затем аспирируйте среду и замените ее 100 микролитрами буфера для лизиса клеток млекопитающих на 10 миллионов клеток.

Растирайте смесь для лизиса клеток с помощью иглы 20-25 калибра. Затем переложите лизат клеток в предварительно охлажденную 1,50-миллилитровую пробирку, и инкубируйте лизат на льду в течение 10 минут с периодическими инверсиями. Через 10 минут центрифугируйте лизат и переложите надосадочную жидкость в прохладную пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Затем приготовьте разведение лизата в соотношении 1:10 в воде, не содержащей нуклеаз, и измерьте поглощение на 260 нанометрах. Затем создайте 200-микролитровые аликвоты из неразбавленного лизата и обработайте каждую 7,5 единицами нуклеазы для каждой единицы поглощения. Дайте нуклеазе вступить в реакцию в течение 45 минут, а затем завершите реакцию с помощью 15 микролитров ингибитора РНКазы или храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Затем очистите РНК RPF с помощью коммерческого набора, а затем исчерпайте запасы рРНК, также используя набор. Затем проведите очистку PAGE на 500 нанограммах выделенной RPF РНК. После подготовки образцов к загрузке в гель, денатурируйте их, последний и контролируя, с пятиминутной инкубацией при 95 градусах Цельсия.

Затем запустите образцы при напряжении 180 вольт в течение примерно 75 минут и оцените результаты. Для сбора гелевого среза проделайте отверстия на дне 0,5-миллилитровой трубки с помощью стерильной иглы 20-го калибра. Далее вырезаем гелевые срезы, соответствующие области нуклеотидов от 28 до 30, и переносим их в подготовленные 0,5-миллилитровые пробирки.

Включите образец контроля РНК и образец отрицательного контроля для проверки на загрязнение. Затем загрузите маленькие пробирки с закрытыми пробами в более крупные микроцентрифужные пробирки. Затем центрифугируйте сборки, чтобы измельчить гель, и перенесите образец в 1,5-миллилитровую пробирку.

Затем добавьте воду, ацетат аммония и SDS в пробирки с образцами, чтобы вымыть РНК в ночной реакции при четырех градусах Цельсия. Затем используйте коммерческий набор для создания библиотеки кДНК из малой РНК и приступайте к секвенированию библиотеки кДНК. ChIP-seq используется для картирования связывания интересующего фактора транскрипции по всему геному.

В сочетании с данными профилирования рибосом и обзором всех новых транскриптов, ChIP-seq раскрывает фактическое влияние связывания транскрипционного фактора. Для начала сшить образцы клеток с помощью формальдегида до конечной концентрации 1%Через 10 минут при комнатной температуре с легким покачиванием остановить реакцию, повысив концентрацию глицина до 0,125 моляра. Затем соберите клетки и трижды промойте их ледяным PBS, а затем заморозьте гранулу ячейки при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Позже ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре ледяного буфера для лизиса клеток с добавленными только что добавленными ингибиторами протеазы и инкубируйте клетки на льду в течение 10 минут. Через 10 минут раскрутите клетки, аспирируйте надосадочную жидкость и повторите добавление буфера лизиса и инкубацию. Затем используйте ультразвуковую обработку для генерации сдвигового хроматина между 200 и 1000 пар оснований.

Затем соедините хроматин с магнитными шариками, покрытыми антителами, и разбавьте комплексы белок-ДНК в 50 микролитрах элюирующего буфера. Затем добавьте пять микролитров 40%-ной РНКазы и элюирующего буфера и инкубируйте образец в течение 30 минут. Затем добавьте в образец одну единицу протеиназы К и 20 микрограммов гликогена, и инкубируйте его в течение двух часов.

Затем переместите образец до 65 градусов Цельсия на ночь, чтобы сшить его в обратном направлении. На следующий день поместите образец против магнита не менее чем на 30 секунд, а затем соберите надосадочную жидкость, которая содержит интересующую вас ДНК. Затем очистите ДНК, используйте количественную ПЦР для проверки и секвенируйте ДНК.

4sU-мечение может вызвать стресс у клеток и привести к апоптозу. Для идентификации апоптотических и мертвых клеток использовали аннексин V и окрашивание 7-AAD. После мечения клеток Th1 с помощью 4sU с использованием 30 или 60-минутных процедур клетки не погибли и не подверглись апоптозу.

Целостность РНК всегда проверялась перед секвенированием с помощью стандартного анализа, так как это имеет большое значение при обработке РНК. Амплифицированные библиотеки имели здоровый диапазон нуклеотидов. Избыток димеров адаптера нуждался в дальнейшей очистке с помощью PAGE.

Было обнаружено, что сдвиг хроматина работает лучше всего, когда основная фракция срезаемого хроматина составляет около 1000 пар оснований или немного меньше. Количественная ПЦР была использована для проверки применимости антитела к иммунопреципитационному секвенированию хроматина. Праймеры отрицательного контроля предназначены для генов, не экспрессируемых в представляющих интерес клетках.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать составить подробный план экспериментальной установки, включая график добавления 4sU и сбора клеток для каждого метода. Всегда проверяйте оптимальные условия мечения 4sU, заранее проверяя влияние 4sU на жизнеспособность клеток и реакцию на стресс. Таким образом, такой подход позволяет нам визуализировать все события регуляции генов, которые могут происходить в процессе клеточной активации.

Этот метод также может быть использован для первичных иммунных клеток и их реакции на стимулы или лекарственные препараты.