Создание колонизации Assay легких для циркулирующих визуализации опухолевых клеток в тканях легких

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метастазирования рака о роли колонизации легких в достижении метастазирования рака. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ранние экстравазированные раковые клетки могут быть визуализированы в легких во время метастазирования рака. Демонстрировать процедуру будет Ченг-Хан Янг, аспирант из моей лаборатории.

Когда культура опухолевых клеток достигнет 70-80 процентов конфлюенции, промойте культуру два раза в двух миллилитрах стерильного PBS на одну промывку и добавьте один миллилитр 0,5% трипсина-ЭДТА в чашку для культивирования. Немедленно удалите 800 микролитров надосадочной жидкости и поместите чашку для культуры при температуре 37 градусов Цельсия на 30-60 секунд, пока большинство клеток не отделится от планшета. Добавьте один миллилитр свежей среды, дополненной 10% FBS, чтобы остановить реакцию, и с помощью пипетки объемом 1000 микролитров энергично перемешайте клеточный раствор.

Перелейте полученную одноклеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и соберите клетки путем центрифугирования. Затем повторно суспендируйте гранулу опухолевой клетки в 1,5 миллилитрах среды с добавлением 20% FBS и вращайте клетки в течение двух часов, при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью исключения трипанового синего и соберите их центрифугированием.

Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре стерильного PBS для повторного центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах PBS с добавлением 10% FBS и 20 микромиллилитрах CFSE. Через десять минут при 37 градусах Цельсия в темноте центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулу в четырех миллилитрах среды, дополненной одним процентом FBS для еще одного центрифугирования. После последней промывки повторно суспензируйте клетки до пяти умно-десяти на шестую опухолевые клетки на миллилитр свежей среды без концентрации FBS и поместите клетки на лед.

Затем согрейте хвост четырех-шестинедельного самца мыши C570 Black Six в течение пяти-десяти минут, чтобы расширить хвостовые вены, и используйте одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 26 с половиной калибра, чтобы тщательно перемешать клетки до получения суспензии в одну клетку. Осторожно загрузите в шприц 200 микролитров клеток и поместите мышь в ограничитель. Затем вводят весь объем клеток в просвет расширенной хвостовой вены.

В подходящий момент времени после инъекции сделайте продольный разрез кожи и подкожной клетчатки от живота до грудной клетки и откройте плевральную полость, чтобы обнажить сердце и легкие. Используя стерильные хирургические швы, перевязать верхнюю и нижнюю полые вены, чтобы предотвратить обратный поток обильного раствора, и с помощью ножниц сделать двух-четырехмиллиметровую трещину в левом желудочке, чтобы облегчить отток перфузата из легких. Затем с помощью трехмиллилитрового шприца введите PBS в правый желудочек и используйте непрерывное отсасывание для удаления слитого раствора до тех пор, пока легкие не изменят цвет с красноватого на полностью бледный.

Позаботьтесь о том, чтобы правильно закрепить верхнюю и нижнюю полые вены для успешной перфузии легких. После забора легких поместите доли в изготовленный на заказ держатель для легких в шестисантиметровой чашке и закрепите легкие на сетчатой текстуре держателя. Накройте и увлажните лепестки PBS и поместите чашку с культурой на визуализирующий столик конфокального микроскопа.

Выберите объектив 5x и поверните колесо фильтров в положение NIBA. Используя лазер с яркостью 488 нанометров, возбуждайте CFSE, чтобы обеспечить четкую визуализацию флуоресцентных синих меченых опухолевых клеток в долях легких. Поверните колесо фильтра в положение R690, чтобы сканировать со скоростью сканирования две микросекунды на пиксель и оптимизировать уровни усиления и смещения при высоком напряжении.

Затем сделайте пять флуоресцентных изображений размером 12 на пять с разрешением 12 пикселей со скоростью сканирования 10 микросекунд на пиксель. Используя метод окрашивания, как только что было продемонстрировано, опухолевые клетки эффективно мечаются CFSE дозозависимым образом. При флуоресценции интенсивность мечения, почти достигающая плато в шесть раз по 10 до пятой части клеток рака легкого Льюиса на миллилитр при концентрации 20 мкмольяр.

Перфузия легких перед забором, как только что продемонстрировано, очищает сосудистую сеть легких от неспецифически измельченных циркулирующих опухолевых клеток перед визуальным анализом. Флуоресцентная конфокальная микроскопия выявляет наличие колонизирующих меченных CFSE опухолевых клеток в собранных и перфузированных долях легких. Использование соответствующего программного обеспечения для анализа изображений для преобразования флуоресцентных изображений в черно-белые облегчает количественную оценку колонизации легких.

Внутривенное введение фибронектина, экспрессирующих фибронектин, или скремблированных фибронектин-экспрессирующих клеток карциномы легких Льюиса демонстрирует значительно меньшее количество фибронектин-экспрессирующих клеток в легочной ткани, собранных через 38 и 45 часов после инъекции, что подчеркивает роль фибронектина в колонизации доли легкого и развитии опухоли. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о тщательной перфузии легких, чтобы можно было смыть неприкрепленные клетки. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области метастазирования рака к изучению колонизации легких путем циркуляции опухолевых клеток в мышиной модели с нулевым граммом.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как флуоресцентно мечить суспензии опухолевых клеток, внутривенно инокулировать опухолевые клетки, перфузировать легкие мыши, а также использовать конфокальную флуоресцентную микроскопию для визуализации метастазировавших опухолевых клеток.