Создание основной культуры саркомы мягких тканей, пациент производные

Общая цель этой доклинической модели человека, полученной на основе хирургически резецированной опухолевой ткани, заключается в получении первичной культуры саркомы мягких тканей, полученной от пациента. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о патофизиологии саркомы мягких тканей и представляет собой важный доклинический инструмент для прогнозирования ответа на терапию. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она представляет собой полностью человеческую доклиническую модель.

Применение этого метода распространяется и на терапию саркомы мягких тканей, поскольку эта доклиническая модель может быть протестирована с обычными инновационными препаратами для изучения их активности и механизма действия. Хотя этот метод может дать представление о саркоме мягких тканей, он также может быть применен для изучения взаимодействия клеток мягких тканей раковых клеток. Люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за гетерогенности опухолевых тканей и изоляции опухолевых клеток.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку первоначальный отбор клеток саркомы мягких тканей и этапы БК требуют определенного опыта, прежде чем можно будет достичь мастерства. Образцы опухолей следует принимать в 100 миллилитровом стерильном контейнере для мочи с 50 миллилитрами среды с низким содержанием глюкозы DMEM, запечатанном парафиновой пленкой. Образцы могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия в течение максимум трех часов после резекции опухоли.

Простерилизуйте капюшон для культивирования тканей с 70% этанолом и простерилизуйте пинцет из нержавеющей стали с 70% этанолом. Снимите парафиновую пленку с контейнера для мочи и выбросьте. Очистите внешнюю сторону контейнера для мочи 70% этанолом.

Откройте квадратную чашку Петри, затем откройте контейнер для мочи и с помощью стерилизованного стального пинцета INOX перенесите образцы опухоли в чашку. Добавьте PBS и промойте образец опухоли дважды. После промывки мелко нарежьте образец опухоли на кусочки размером от одного до двух миллиметров.

Переложите четверть всего образца в двухмиллилитровую пробирку. Затем добавьте в пробирку один миллилитр реактива ТРИзол и сразу заморозьте при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Соберите оставшийся мелко измельченный опухолевый материал в пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте четыре миллилитра раствора коллагеназы первого типа.

Затем разведите раствор коллагеназы первого типа с четырьмя миллилитрами питательной среды, закройте пробирку, и запечатайте парафиновой пленкой. Выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в шейкере в течение 15 минут, чтобы активизировать пищеварение. Через 15 минут поместите трубку с шейкером при комнатной температуре и оставьте на ночь.

На следующий день аккуратно отфильтруйте клеточную суспензию через стерильный фильтр 100 микрон в 50-миллилитровую пробирку. Затем промыть фильтр питательной средой и центрифугировать фильтрат при 225 раз g в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув трубку, и повторно суспендируйте клетки одним-двумя миллилитрами питательной среды.

После подсчета клеток и вычисления количества клеток поместите клетки в стандартную монослойную культуру с плотностью 80 000 клеток на квадратный сантиметр. Чтобы подготовить цитологический образец, начните со сбора 100 000 клеток в 200 микролитрах питательной среды. Пипеткой наденьте раствор в одноразовую воронку, оснащенную фильтром и смонтированную со стеклянным предметным стеклом.

Откройте цитоцентрифугу и вставьте образцы. После цитоцентрифугирования выбросьте воронку, оборудованную фильтром. Затем зафиксируйте предметное стекло в ацетоне на 10 минут, а затем хлороформ на пять минут.

Пройдите клетки STS, когда слияние составляет около 90%После промывания клеточного листа PBS добавьте два-три миллилитра 1X Trypsin в PBS и инкубируйте в течение трех-пяти минут при 37 градусах Цельсия. После инкубации с помощью пипетки объемом от 200 до 1000 микролитров соберите отделенные клетки и переложите их в пробирку объемом 15 миллилитров. Добавьте четыре миллилитра среды, чтобы остановить ферментативную реакцию.

Затем центрифугировать при 225 умноженных на г в течение пяти минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу, добавив один миллилитр среды, и засейте клетки в новую культуральную пластину или колбу. Опухолевые клетки были выделены из липосаркомы, удаленной хирургическим путем у 54-летнего пациента.

Флуоресцентную гибридизацию in situ проводили для выявления амплификации MDM2 в образце ткани пациента. Цитологический анализ амплификации MDM2 в изолированных опухолевых клетках подтверждает создание первичной культуры, полученной от пациента. Морфологические изменения от основания были вызваны при обработке культур ифосфамидом, эпирубицином, ифосфамидом и эпирубицином, трабектедином и эрибулином.

Для каждого эксперимента на жизнеспособность были проведены три независимых повтора. Полученные результаты подтвердили чувствительность культур к химиотерапии. Наиболее активным лечением была комбинация Ифосфамида и Эпирубицина, терапии первой линии, используемой при прогрессирующем или метастатическом АЛТ-ДДЛПС.

После освоения этой техники ее можно сделать за 15-16 часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о мелком измельчении образца опухоли. После этой процедуры могут быть проведены различные последующие анализы, включая профилирование экспрессии генов, иммуногистохимический анализ или анализ цитотоксичности, чтобы ответить на дополнительные вопросы о биологии саркомы мягких тканей.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области саркомы мягких тканей к изучению естественной истории этих малоизученных злокачественных новообразований. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как установить первичную культуру саркомы мягких тканей пациента. Не забывайте, что работа с биологическими образцами и лекарствами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и работа с вытяжным шкафом.