Простой и недорогой Assay для измерения передвигаться в моделях мыши мышечной дистрофии
29 декабря 2017 г.
Этот протокол описывает гибкий, лоу кост системы для измерения мыши передвигаться в открытом поле деятельности assay. Мы показывают, что 6-минутный передвигаться пробирного, основанными на этой системе обнаруживает снижение добровольного движения в многомерных выражений мышей и точно отличает улучшение мышц конкретных спасения этих животных.
Общая цель этого анализа состоит в том, чтобы измерить произвольную способность к передвижению у мышей с мышечной дистрофией. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мышечной дистрофии о прогрессировании мышечной слабости в мышиных моделях мышечной дистрофии и эффективности потенциальных методов лечения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает неинвазивное и воспроизводимое измерение активности животных, которое может быть легко адаптировано к различным условиям исследования.
В тихой комнате с регулируемой температурой в постоянное время суток разместите камеру на проволочной сетке над камерой для занятий, чтобы можно было вести запись по всей арене, и очистите камеру дезинфицирующим средством. Непосредственно перед записью упражнения позвольте мыши ухватиться за стержень цифрового манометра и осторожно потяните назад, пока стержень не будет отпущен. Запишите пиковое напряжение в ньютонах для каждого испытания.
С одной минутой отдыха между испытаниями. Сразу после анализа силы хвата поместите мышь в камеру и начните запись видео, позволяя мыши свободно исследовать. Через шесть минут остановите запись и верните мышь в ее домашнюю клетку.
Для отслеживания анализа видеоданных сначала откройте запись в соответствующей программе для редактирования видео и установите скорость в два раза. Экспортируйте уничтоженное видео в формате mp4 для анализа трекинга и откройте видео в соответствующей программе для анализа видео. Чтобы настроить калибровку для видеозаписи, с помощью инструмента «Линия» нарисуйте линию вдоль одной стороны камеры.
Щелкните правой кнопкой мыши по строке, выберите «Калибровать измерение» и введите фактический размер стороны камеры в сантиметрах. Чтобы начать полуавтоматическое отслеживание положения мыши, нажмите на перемещение курсора. Начиная с начального кадра в видео, щелкните правой кнопкой мыши по точке, которую нужно отслеживать.
Точка трекинга будет отмечена синим кружком. Используйте стрелку вправо на клавиатуре для продвижения кадра. Точка слежения должна автоматически перемещаться исходя из положения хвостовой базы.
Если положение слежения не выровнено по интересующей точке в данном кадре, вручную выровняйте синий круг по положению отслеживания. Когда все видео будет отслежено, сохраните видео и наложение трассировки и выберите «Экспортировать в таблицу», чтобы экспортировать позиционные данные трассировки. В соответствии с результатами, полученными в ходе аналогичных анализов, мыши с нулевым дистрофином mdx, получавшие протокол физических упражнений непосредственно перед тестированием, демонстрировали значительно меньше произвольных движений в течение шестиминутного теста в открытом поле, чем животные дикого типа.
Действительно, после умеренного напряжения силы хвата, мыши mdx обычно оставались неподвижными в течение первых нескольких минут протокола передвижения, с небольшим увеличением движений к четырем-пятым минутам. Однако при сравнении диких животных и животных mdx без физических упражнений не обнаруживается никаких различий в пройденном расстоянии. Мыши-трансгены Mdx по экспрессии утрофина неотличимы от животных дикого типа без существенных различий в общем пройденном расстоянии или в любом из наблюдаемых моментов времени компенсации.
Чтобы определить влияние снижения частоты дискретизации, было измерено общее расстояние, пройденное за одну минуту видео с полной частотой кадров, и сравнено с измерениями расстояния, полученными из версий набора данных с уменьшенной дискретизацией. Уменьшение частоты кадров вдвое уменьшило измеренное расстояние на 5% от исходного рассчитанного расстояния. Точность измеренного расстояния резко падает после этого момента, хотя даже сильно разреженные наборы данных по-прежнему близко приближаются к траектории животного, подчеркивая важность учета частоты кадров и обработки сигнала при оценке активности животного и демонстрируя, что высокое пространственное разрешение может быть сохранено в видеоданных с уменьшенной дискретизацией.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как записывать и анализировать передвижение мыши в условиях открытого поля. После освоения этот анализ может быть завершен за 15-30 минут при правильном выполнении. Этот недорогой и неинвазивный анализ позволяет исследователям изучить двигательную активность в мышиных моделях мышечной дистрофии и может служить информативным первым шагом для дальнейших функциональных измерений.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается гибкая и недорогая система для измерения локомоторной активности мышей в тесте «открытое поле». Этот метод обеспечивает неинвазивное и воспроизводимое измерение активности животных и может быть адаптирован к различным условиям исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Исследование мышечной дистрофии
- Поведенческий анализ
Теоретические основы
- Данный анализ позволяет измерить произвольную локомоцию на мышиных моделях мышечной дистрофии.
- Он дает ответы на ключевые вопросы, касающиеся прогрессирования мышечной слабости.
- Метод разработан для оценки эффективности потенциальных терапевтических средств.
- Регистрация данных проводится в контролируемой среде для обеспечения согласованности результатов.
Цель исследования
- Для измерения произвольных движений у мышей линии mdx.
- Для оценки влияния специфических для мышц вмешательств.
- Для получения данных о прогрессировании мышечной дистрофии.
Используемые методы
- Использование камеры, расположенной над камерой активности, для записи процесса.
- Очистка камеры дезинфицирующим средством перед проведением испытаний.
- Предоставление мыши возможности ухватиться за стержень для измерения пикового натяжения.
- Регистрация активности в течение 6-минутного теста на амбулацию.
Основные результаты
- Система регистрирует снижение произвольной двигательной активности у мышей линии mdx.
- Она позволяет точно дифференцировать улучшения, вызванные специфическим восстановлением функций мышц.
- Результаты воспроизводятся в различных сериях испытаний.
- Метод может быть адаптирован к различным условиям исследований.
Выводы
- Данный анализ эффективен для изучения мышечной дистрофии у мышей.
- Он предоставляет ценные данные об эффективности потенциальных методов лечения.
- Этот подход гибок и может быть использован в различных исследовательских условиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Измерение произвольной локомоции на мышиных моделях обеспечивает трансляционный показатель двигательной функции при мышечной дистрофии, что напрямую аналогично таким клиническим конечным точкам, как тест 6-минутной ходьбы. Этот недорогой анализ на основе видеофиксации позволяет проводить воспроизводимую неинвазивную оценку прогрессирования заболевания и терапевтического ответа в доклинических исследованиях. Выявляя дефицит активности у мышей mdx с отсутствием дистрофина и восстановление функции за счет экспрессии утрофина, данный метод способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков при разработке нейромышечных препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем количественной оценки произвольного передвижения как функционального показателя мышечной силы в моделях дистрофии.
- Операционная ценность: обеспечивает снижение биологических рисков за счет воспроизводимой корреляции генотипа и фенотипа у мышей mdx по сравнению с группами дикого типа и группами с восстановленным фенотипом.
- Прогностическая ценность: помогает в приоритизации портфеля исследований, позволяя выявить эффективные вмешательства (например, трансген утофина), которые нормализуют уровень активности до показателей дикого типа.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений с использованием стандартизированных показателей амбулации в открытом поле.
- Воспроизводимость: Получение количественных данных по пройденному расстоянию и времени, что позволяет стандартизировать анализ в разных лабораториях.
- Масштабируемость: Использование бесплатного программного обеспечения с открытым исходным кодом и доступного оборудования, что позволяет повторно использовать платформу в различных исследовательских условиях без необходимости в специализированном оборудовании.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует релевантные для пациентов нарушения локомоции, обеспечивая трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации.
- Снижение механистических рисков: Позволяет определить, обусловлены ли наблюдаемые эффекты специфическим восстановлением мышечной функции или неспецифическими изменениями активности.
- Принятие решений с учетом рисков: Обосновывает критерии принятия решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем корреляции восстановления локомоции с взаимодействием с мишенью и модуляцией сигнального пути.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум поиска новых препаратов — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая функциональный связующий этап между молекулярными механизмами и фенотипическими результатами в моделях мышечной дистрофии.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем установления связи между генетическими или фармакологическими вмешательствами и измеримыми изменениями произвольных движений.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимого видеотрекинга, который генерирует количественные показатели локомоции для оценки соединений.
- Аналитика: создает потоки пространственных и временных данных, позволяя исследовательским группам сравнивать локомоторную активность для разных генотипов, вариантов лечения и временных точек.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом путем имитации клинических оценок амбулации, что способствует согласованию биомаркеров и предиктивному моделированию.
- Корпоративное использование: создает возможность многократного использования недорогого метода тестирования амбулации, что снижает зависимость от специализированных базовых центров.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в тестах двигательной функции.
- Операционная ценность: Повышает уровень стандартизации и воспроизводимости благодаря использованию трекинга с открытым исходным кодом и контролируемым условиям окружающей среды.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет устранения необходимости в дорогостоящих системах отслеживания движений при сохранении качества данных.
- Влияние на портфель: Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе функционального восстановления фенотипов амбулации в доклинических моделях.
Особенности реализации
- Требуются базовые навыки видеозаписи и работы с программным обеспечением для трекинга с открытым исходным кодом (например, ручного покадрового выравнивания).
- Зависит от стандартного оборудования для визуализации и стабильного контроля условий окружающей среды (освещения, температуры, времени суток).
- Необходимо строгое соблюдение протокола всеми командами для обеспечения воспроизводимости результатов в разных центрах и разными операторами.
- Требуется учет особенностей адаптации для камер различных размеров, разных линий мышей и уровней активности.
- Предполагает компромисс между частотой кадров и точностью измерений, так как понижение частоты дискретизации снижает точность расчета расстояния.
