Оптимальная подготовка формалин фиксированной образцы для пептида основан матрицу помогает лазерная десорбция/ионизации масс-спектрометрия визуализации рабочих процессов

Общая цель этой процедуры заключается в воспроизводимой подготовке образца ткани для пептидной масс-спектрометрической визуализации. Этот метод позволяет начинающим пользователям масс-спектрометрии разрабатывать свои собственные рабочие процессы масс-спектрометрии с визуализацией без длительных эмпирических определений. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обладает высокой воспроизводимостью, проста в реализации и использует экономически эффективные методологии.

Для приготовления предметных стекол, покрытых нитроцеллюлозой, нанесите пипеткой 40 микролитров жидкой нитроцеллюлозы на один край предметного стекла микроскопа из оксида индия-олова. С помощью обычного предметного стекла для стеклянного микроскопа проведите нитроцеллюлозу под поверхностным натяжением по предметному стеклу, чтобы создать ровное тонкопленочное покрытие. Дайте нитроцеллюлозе высохнуть при комнатной температуре в течение 20 секунд, а затем храните до тех пор, пока это не понадобится, при комнатной температуре.

Затем создайте пользовательские испарительные камеры, вырезав лист плотной промокательной бумаги достаточно большого размера, чтобы поместиться на нижней половине стандартной пластиковой чашки Петри. Разрежьте бумагу так, чтобы в центре осталась прямоугольная полоска такого же размера, как предметное стекло микроскопа. Оставьте достаточно излишков, чтобы бумага сохранила свое положение в чашке Петри.

Для ткани FFPE смонтируйте секции с помощью флоат-имплантата на предметные стекла ITO с предварительно нитроцеллюлозным покрытием, как описано в текстовом протоколе. Погрузите предметные стекла в свежий ксилол для удаления остатков парафина на две минуты. Промойте депараффизированные образцы, погрузив предметные стекла в серию растворителей, состоящую из 70%-ного объема объемного водного раствора этанола, за которым следует 100%-ный этанол, на 30 секунд.

Затем погрузите предметные стекла в жидкость Карноя на две минуты. Наконец, погрузите предметные стекла в серию из 100% этанола, сверхчистой воды и снова 100% этанола на 30 секунд. Загрузите предметные стекла в пластиковую коробку, которая заполнена доверху 20 миллимолярным трис HCO.

Закройте коробку и поместите ее на водяную баню, содержащую 500 миллилитров воды, позволяя коробке касаться дна ванны. Затем нагрейте коробку в течение 15 минут при температуре 120 градусов Цельсия в скороварке, которая может достичь рабочего давления 70 килопаскалей. Снимите слайды, дайте им остыть и дайте им высохнуть при температуре окружающей среды в течение 15 минут.

После гидролиза покройте образцы 10 микролитрами раствора трипсина в сверхчистой воде, предварительно нанеся 10 микролитров раствора пипетированием на край участка ткани. Затем с помощью того же наконечника пипетки проведите каплей по всей поверхности ткани под поверхностным натяжением. Дав образцам высохнуть при температуре окружающей среды, установите их внутри верхней части ранее построенной испарительной камеры с помощью автоклавной ленты по обоим краям предметного стекла.

Осторожно нанесите 600 микролитров раствора, содержащего один к одному объемный объем смеси 100% ацетонитрила и 50 миллимолярного бикарбоната аммония, на палец промокательной бумаги в нижней части чашки Петри до тех пор, пока палец не станет равномерно влажным. Пипетирование имеет решающее значение, потому что неправильное пипетирование приведет к делокализации матричных и поверхностных аналоидов, что приведет к разрушению пространственной информации, содержащейся в образце. Поместите верхнюю половину испарительной камеры на нижнюю, убедившись, что бумажный палец и предметное стекло идеально совпадают, и запечатайте камеру вокруг ее экватора парафиновой пленкой.

Оставьте образец на ночь в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, чтобы обеспечить полное переваривание. После разложения оставьте предметное стекло на пятизначных микроаналитических весах. Установите предметное стекло на охлаждающий палец сублимационного аппарата и закрепите его медной лентой таким же образом, как описано для испарительной камеры.

Поместите 300 миллиграммов матрицы CHCA в стеклянную чашку Петри на дне камеры и равномерно распределите ее, чтобы создать тонкий слой кристаллов матрицы. Соберите сублиматор. И закрепите две половинки подковообразным зажимом.

Подвесьте собранный агрегат на высоте от 15 до 20 сантиметров над песчаной баней, предварительно разогретой до 220 градусов Цельсия, поместив его в металлическое кольцо, соединенное с ретортной подставкой. Подключите камеру к источнику вакуума, включите вакуум и дайте ему стабилизироваться примерно до 25 миллиторр в течение пяти минут. Упакуйте охлаждающий палец доверху льдом и добавьте 50 миллилитров воды.

Дайте аппарату отстояться еще пять минут, прежде чем продолжить. Опустите камеру на поверхность подставки, убедившись, что песок полностью соприкасается со дном камеры. Оставьте на 45 минут, чтобы создать идеальное покрытие в 0,22 миллиграмм на квадратный сантиметр.

Через 45 минут извлеките камеру из песчаной ванны, подняв металлическое кольцо, и продуйте камеру. После сублимации установите предметное стекло внутри верхней части ранее построенной испарительной камеры, как и раньше. Осторожно нанесите пипеткой 600 микролитров раствора, содержащего один к одному объем смеси ацетонитрила и трифторуксусной кислоты в воде, на промокательную бумагу в нижней части чашки Петри, чтобы обеспечить равномерное покрытие.

Затем соберите камеру, убедившись, что язычок для бумаги и предметное стекло микроскопа идеально совпадают. Оставьте камеру в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия на один час. Отсканируйте предметное стекло с помощью планшетного сканера, чтобы создать цифровое изображение.

Загрузите образец в масс-спектрометр, а затем проанализируйте с помощью соответствующей программной платформы. Наконец, проанализируйте образцы, как описано в текстовом протоколе. Здесь показан правильно обработанный образец ткани, который был отснят на 50 микрон и демонстрирует хорошую макроструктуру и четкую разницу между белым и серым веществом.

Успешно сравненные образцы покажут четкую дифференциацию в разных местах расположения тканей. Здесь есть четкая область апрегуляции пептида, представленная отношением массы к заряду 1085 в области белого вещества, представленной белыми областями. Напротив, этот неправильно подготовленный образец демонстрирует масштабный уровень делокализации.

Структура молекул, присутствующих на трех панелях, ясно демонстрирует, что нет четкого определения между биологическими областями или различий в распространенности отображаемых молекул. После просмотра этого видео у вас должно сложиться действительно хорошее представление о том, как подготовить свои собственные образцы к пептидному визуализирующему анализу. При правильной процедуре этот метод может быть выполнен в течение восьми часов в течение двух дней, что позволяет провести ночной этап пищеварения.

При подготовке этой методики важно проявлять осторожность на каждом этапе. Любое физическое повреждение ткани приведет к разрушению пространственной информации, содержащейся в образце. Идея этой методологии пришла нам в голову, когда мы впервые начали собственные космические исследования IMS и поняли, что других окончательных методологий не существует.

С небольшими модификациями наша методология может быть применена к анализу белков, пептидов, липидов и других малых молекул. После этой процедуры к образцу могут быть применены другие гистологические методы, такие как иммунофлуоресценция и окрашивание гематоксилином и эозином, чтобы получить точку отсчета для данных масс-спектрометрии визуализации. При работе с потенциально взрывоопасными химическими веществами, такими как жидкая нитроцеллюлоза, важно соблюдать правильные процедуры безопасности.

Минимизация рабочих объемов и немедленная утилизация отходов имеют решающее значение.