Кинетическая на основе флуоресценции Ca^{2 +} мобилизации Assay для определения G белка в сочетании рецепторов агонистов, антагонисты и аллостерический модуляторы

Общей целью этого клеточного анализа является идентификация и характеристика молекул, способных стимулировать или ингибировать внутриклеточную мобилизацию кальция, опосредованную рецептором G-белка. Этот метод может быть ценным анализом для открытия лекарств, сопряженных с рецепторами G-белка, поскольку он может быть использован для скрининга молекул, которые модифицируют рецептор-опосредованные внутриклеточные кальциевые тельца. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет идентифицировать молекулы с агонистическими или антагонистическими свойствами в рамках одного и того же анализа.

Этот анализ может помочь в открытии новых кандидатов в лекарства, которые действуют на рецепторы, сопряженные с G-белком, перспективные терапевтические мишени, играющие роль во многих заболеваниях человека. В день пропускания клеток покройте каждую лунку из 96-луночного планшета из полистирола с черными стенками и прозрачным дном 100 микролитрами 0,1%-ного раствора желатина и инкубируйте пластины в течение двух часов при комнатной температуре. Пока желатин затвердевает, используйте раствор трипсина ЭДТА, чтобы поднять интересующие клетки со дна их культуральной колбы, повторно суспендируя клетки в свежей питательной среде в конической пробирке объемом 50 миллилитров после того, как они отделятся.

После подсчета соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в свежей питательной среде в концентрации от 10 до 10 до пятой части жизнеспособных клеток на миллилитр. Когда пластины будут готовы, выбросьте излишки желатинового раствора и высушите пластины на лабораторной салфетке. Затем промойте лунки 200 микролитрами PBS и замените промывку 200 микролитрами клеток на лунку для ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

На следующее утро постучите по тарелке, чтобы выбросить питательную среду из лунок, и высушите тарелку вверх ногами на бумажном полотенце. Затем пометьте клетки в каждой лунке 100 микролитрами раствора красителя на лунку и инкубируйте планшет в течение 45 минут в темноте при комнатной температуре. Пока клетки инкубируются, добавьте 75 микролитров CXCL12 на лунку в хемокиновую пластину и 50 микролитров интересующего соединения в каждую лунку компаундной пластины.

Затем включите блок охлаждения считывателя флуоресцентных пластин, а затем сам считыватель пластин. Дав системе несколько минут на запуск, откройте программное обеспечение для считывания пластин. Чтобы настроить протокол анализа, на вкладке настроек выберите режим чтения и соответствующие длины волн возбуждения и излучения для загружающего красителя.

Выберите вкладку «Смесь с передаточной жидкостью» для автоматического смешивания соединений в компаундной пластине. На вкладке передаточной жидкости установите по 20 микролитров каждой лунки из составной пластины, которая должна быть перенесена, в измерительную пластину и расположите наконечники пипеток на 20 микролитров ниже поверхности жидкости. Установите скорость аспирации на 50 микролитров в секунду и скорость дозирования на 25 микролитров в секунду и нажмите прочитать с передаточной жидкостью.

В течение первого интервала выберите 60 считываний с интервалом считывания в одну секунду, при этом 10 считываний должны быть записаны до того, как соединения будут выданы на измерительную пластину, и 50 считываний, которые должны быть завершены после. Установите второй интервал с интервалом чтения 30 секунд и 18 чтениями. Выберите три промывки наконечником для протокола, настроив каждый этап промывки так, чтобы он включал соответствующую жидкость для промывки, один цикл стирки, высокую скорость насоса и пять ходов за промывку.

Используйте функцию паузы пипетки, чтобы включить паузу пипеттора в 300 секунд, и используйте настройку смеси с передаточной жидкостью, чтобы обеспечить автоматическое смешивание раствора CXCL12 в хемокиновой пластине. В последующей вкладке жидкости для переноса установите 25 микролитров из каждой лунки хемокиновой пластины, которая должна быть перенесена на измерительную пластину, и расположите наконечники на 20 микролитров ниже поверхности жидкости. Установите скорость аспирации на 50 микролитров в секунду, а скорость дозирования на 25 микролитров в секунду.

Используйте кнопку чтения с передаточной жидкостью, чтобы установить первый интервал, включающий 145 операций чтения с интервалом чтения в одну секунду. Установите второй интервал на время интервала чтения в шесть секунд и 20 операций чтения. Выберите еще три цикла стирки наконечников.

Затем нажмите «Установить температуру рабочей области» и установите температуру устройства на 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации загрузочного красителя выбросьте буфер с измерительной пластины и высушите планшет на лабораторной салфетке. Промойте клетки 150 микролитрами на лунку буфера для анализа, заменив буфер 80 микролитрами буфера для анализа через две минуты.

Поместите измерительную пластину в положение считывания, составную пластину в положение источника два, хемокиновую пластину в положение источника три и коробку с черными наконечниками в положение источника один. Закройте устройство и нажмите кнопку «Тест сигнала протокола», чтобы определить фон относительных световых единиц и дисперсию флуоресценции на пластине. Выберите тестовый сигнал во всплывающем окне.

Если получены фоновые значения от 8 000 до 10 000 относительных единиц света, выберите «Обновить» и нажмите «Сохранить», чтобы сохранить основной протокол. Затем нажмите кнопку «Запустить», чтобы начать анализ. На этом графике можно наблюдать дозозависимое увеличение флуоресценции, коррелирующее с дозозависимым увеличением высвобождения кальция.

Повышение уровня CXCL12-индуцированной флуоресценции позволяет построить кривую реакции на дозу на основе разницы между минимальным и максимальным ответом по сравнению с исходным уровнем между первым измерением после добавления хемокина и окончательным измерением в протоколе. CXCL12 не вызывал флуоресцентного ответа, связанного с кальцием, даже при высокой концентрации, когда использовались клетки, лишенные соответствующего функционального хемокинового рецептора CXCR4, что свидетельствует о рецепторной специфичности измерения, вызванного CXCL12. Ключевым применением этого клеточного анализа является идентификация малых молекул, которые после предварительной инкубации в зависимости от дозы ингибируют индуцированную CXCL12 мобилизацию кальция в клетках по сравнению с контрольными неактивными соединениями, которые не ингибируют ответ.

Для определения ингибирующей активности малых молекул можно построить кривую зависимости от дозы для ингибирующих молекул с помощью нелинейной регрессии. Этот анализ может быть использован для изучения других рецепторов, сопряженных с G-белком, без дальнейшей оптимизации или с минимальной оптимизацией, а также в этом эксперименте, в котором наблюдалось дозозависимое увеличение флуоресценции, когда другой хемокиновый рецептор, CCR5, стимулировался его природным агонистом хемокинов CCL5. После освоения эта методика может быть использована для изучения многих других рецепторов, сопряженных с G-белком, которые сигнализируют через мобилизацию внутриклеточных ионов кальция при активации рецептора.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как этот клеточный анализ может быть использован для идентификации агонистов и антагонистов хемокинового рецептора CXCL4.