A Kinetic Fluorescence-based Ca<sup>2+</sup> Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Sandra Claes; Thomas D'huys; Anneleen Van Hout; Dominique Schols; Tom Van Loy

doi:10.3791/56780

Кинетическая на основе флуоресценции Ca2 + мобилизации Assay для определения G белка в...

JoVE Journal
Medicine

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Medicine

A Kinetic Fluorescence-based Ca²⁺ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Кинетическая на основе флуоресценции Ca2 + мобилизации Assay для определения G белка в сочетании рецепторов агонистов, антагонисты и аллостерический модуляторы

Full Text

9,578 Views

07:41 min

February 20, 2018

DOI: 10.3791/56780-v

Sandra Claes¹, Thomas D'huys¹, Anneleen Van Hout¹, Dominique Schols¹, Tom Van Loy¹

¹Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research,KU Leuven

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This cell-based assay is designed to identify and characterize molecules that can stimulate or inhibit G protein-coupled receptor-mediated intracellular calcium mobilization. It allows for the screening of agents that interact with CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) and can modify receptor-mediated intracellular calcium release.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Pharmacology
Cell Biology

Background

G protein-coupled receptors (GPCRs) are critical therapeutic targets.
Intracellular calcium mobilization is a key signaling pathway.
Identifying modulators of GPCRs can lead to novel drug candidates.
Assays can differentiate between agonistic and antagonistic properties.

Purpose of Study

To develop a method for screening CXCR4-interacting agents.
To facilitate drug discovery for GPCR-related diseases.
To enhance understanding of receptor-mediated signaling.

Methods Used

Cell-based assay using a 96-well plate format.
Coating wells with gelatin to support cell attachment.
Using trypsin EDTA for cell detachment and resuspension.
Screening for molecules that affect intracellular calcium levels.

Main Results

Identification of compounds that can either inhibit or stimulate calcium release.
Demonstration of the assay's ability to screen for both agonists and antagonists.
Potential for discovering new therapeutic agents targeting GPCRs.
Validation of the assay's effectiveness in drug discovery processes.

Conclusions

The assay provides a robust platform for GPCR drug discovery.
It enables the identification of diverse pharmacological agents.
This method may contribute to advancements in treating diseases linked to GPCRs.

Frequently Asked Questions

What is the significance of CXCR4 in drug discovery?

CXCR4 is a GPCR involved in various diseases, making it a key target for therapeutic intervention.

How does the assay differentiate between agonists and antagonists?

The assay measures intracellular calcium levels, allowing for the identification of compounds that either stimulate or inhibit receptor activity.

What type of cells are used in this assay?

The assay utilizes cells that express CXCR4, enabling the study of receptor interactions.

Can this method be applied to other GPCRs?

Yes, the assay can be adapted to study other GPCRs beyond CXCR4.

What are the advantages of using a 96-well plate format?

The 96-well format allows for high-throughput screening of multiple compounds simultaneously.

Is this assay suitable for early-stage drug discovery?

Yes, it is designed to facilitate early-stage screening of potential drug candidates.

Описанные сотовой assay предназначен для идентификации КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4)-взаимодействующих агентов, которые подавляют или стимулировать, либо конкурсной или allosterically, внутриклеточный Ca^{2 +}релиз, инициированных CXCR4 активации.

Общей целью этого клеточного анализа является идентификация и характеристика молекул, способных стимулировать или ингибировать внутриклеточную мобилизацию кальция, опосредованную рецептором G-белка. Этот метод может быть ценным анализом для открытия лекарств, сопряженных с рецепторами G-белка, поскольку он может быть использован для скрининга молекул, которые модифицируют рецептор-опосредованные внутриклеточные кальциевые тельца. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет идентифицировать молекулы с агонистическими или антагонистическими свойствами в рамках одного и того же анализа.

Этот анализ может помочь в открытии новых кандидатов в лекарства, которые действуют на рецепторы, сопряженные с G-белком, перспективные терапевтические мишени, играющие роль во многих заболеваниях человека. В день пропускания клеток покройте каждую лунку из 96-луночного планшета из полистирола с черными стенками и прозрачным дном 100 микролитрами 0,1%-ного раствора желатина и инкубируйте пластины в течение двух часов при комнатной температуре. Пока желатин затвердевает, используйте раствор трипсина ЭДТА, чтобы поднять интересующие клетки со дна их культуральной колбы, повторно суспендируя клетки в свежей питательной среде в конической пробирке объемом 50 миллилитров после того, как они отделятся.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos