Обнаружения диагностических Epitope Зика вирус

Общая цель данного эксперимента заключается в идентификации пептидов, специфичных для вируса Зика, для использования в диагностическом анализе для выявления антител к вирусу Зика. Это критично, так как вирус исчезает из крови примерно за 10 дней, в то время как антитела сохраняются годами. Этот метод позволяет нам идентифицировать антигены и эпитопы с помощью микрочипа всего протеома Зика для идентификации пептидов, которые захватывают антитела IgM или IgG в образце сыворотки инфицированного человека.

Основным преимуществом при обнаружении как ранних антител, IgM, так и более поздних антител, IgG, является предоставление врачу временной шкалы инфекции. И особенно это важно для беременных женщин. Хотя этот протокол дает представление о причине инфекции, вызванной вирусом Зика, он может быть применен к другим патогенам с использованием микрочипа, специфичного для этого патогена, если известна его белковая последовательность.

Обрабатывайте предметное стекло за края в неопудренных перчатках. Размеры предметного стекла составляют 75,4 миллиметра на 25,0 миллиметра и толщина 1 миллиметр. Поместите предметное стекло в инкубационный лоток поверхностью микрочипа вверх.

Заполните пустые держатели слайдов пустыми предметными стеклами, чтобы предотвратить поломку предметного стекла микрочипа. Поместите глянцевую сторону пломбы вниз на печатную поверхность микрочипа. Чтобы обеспечить хорошее положение, перекрывайте отверстия для винтов уплотнения и опорной плиты.

Поместите верхнюю часть лотка на уплотнение, чтобы создать камеру для микрочипов. Закрепите слайд в лотке, одинаково затягивая винты с накатанной головкой один за другим вручную по чередующейся схеме. Начните с верхнего левого угла и продолжайте в нижний правый.

Закройте лоток крышкой. Осторожное обращение с микрочипом имеет важное значение, чтобы не поцарапать поверхность микрочипа. Растворы добавляются в угол камеры микрочипа, а затем удаляются из него.

Сушка микрочипа также важна для получения хорошего изображения сканирования. Инкубируйте микрочип с 2 000 микролитров стандартного буфера на микрочип в течение 15 минут при комнатной температуре на орбитальном вибростенде со скоростью 140 об/мин. Удалите стандартный буфер путем аспирации пипеткой из угла камеры микрочипа, затем заблокируйте микрочип блокирующим буфером на 60 минут при комнатной температуре на орбитальном вибростенде со скоростью 140 об/мин.

Извлеките блокирующий буфер, отсасывая из угла камеры микрочипа с помощью пипетки. Добавьте в микрочип античеловеческое конъюгированное вторичное антитело IgM флуорохрома, разведенное в соотношении 1:5 000 в окрашивающем буфере. Затем инкубируйте микрочип в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте на орбитальном вибростенде со скоростью 140 оборотов в минуту.

Используйте пипетку для удаления вторичного антитела путем аспирации из угла камеры микрочипа. Промойте микрочип в течение одной минуты 2000 микролитрами со стандартным буфером на микрочип при комнатной температуре на орбитальном вибростенде со скоростью 140 об/мин. Снимите стандартный буфер с помощью продемонстрированной техники и повторите промывку два раза.

Далее дважды погрузите предметное стекло в 200 миллилитров свежеприготовленного буфера для погружения. Тщательно высушите микрочип в течение примерно одной минуты, очень осторожно отсасывая лишнюю жидкость сверху вниз предметного стекла, не касаясь поверхности предметного стекла. Проанализируйте предметное стекло с помощью сканера микрочипов, как показано далее в этом видео.

Инактивируйте образец сыворотки при температуре 56 градусов Цельсия на 30 минут. Затем центрифугируйте образец при температуре 16 000 RCF в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Держите образец при температуре четыре градуса Цельсия до использования.

Затем инкубируйте микрочип с буфером для окрашивания в течение 15 минут при комнатной температуре на орбитальном вибростенде со скоростью вращения 140 об/мин. Удалите буфер для окрашивания, отсасывая из угла камеры микрочипа с помощью пипетки. Разбавьте образец сыворотки и окрашивающий буфер, начиная с разведения 1:1 000.

Инкубируйте разведенный образец с помощью микрочипа в течение ночи при четырех градусах Цельсия на орбитальном вибростенде со скоростью 140 об/мин. Удалите разведенный образец сыворотки с помощью продемонстрированной методики. Затем промойте микрочип три раза, как и раньше.

Разведите вторичное антитело в окрашивающем буфере. Используйте конъюгированное антитело против флуорохрома человека или конъюгированное антитело против флуорохрома человека в соотношении 1:5 000 в буфере для окрашивания. Затем смешайте меченое контролируемым антитело в разведении 1:1000 в окрашивающем буфере с разведенным вторичным антителом.

Инкубируйте с помощью микрочипа в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте и на орбитальном шейкере со скоростью 140 об/мин. Удалите смесь разбавленных вторичных и меченых антител путем аспирации из угла камеры микрочипа с помощью пипетки. Затем трижды промойте микрочип стандартным буфером.

Каждая промывка происходит в течение одной минуты на орбитальном вибростенде со скоростью 140 об/мин. Наконец, снимите промывочный буфер из камеры микрочипа, как и раньше. Чтобы выполнить сканирование микрочипа, дважды погрузите предметное стекло в 200 миллилитров свежеприготовленного погружного буфера.

Высушите микрочип в течение примерно одной минуты, очень осторожно отсасывая сверху вниз предметного стекла, не касаясь поверхности предметного стекла. Отсканируйте микрочип, следуя инструкциям сканера. Поместите предметное стекло на сканер отпечатанной поверхностью вверх.

Создайте новый проект и выберите область сканирования. Установите параметры сканера с разрешением 21 мкм, интенсивностью 7,0 для каналов 700 и 800 нанометров, качеством сканирования среды и смещением 0,8. Получите и сохраните отсканированное изображение в формате 16-битного файла TIF в оттенках серого.

Чтобы проанализировать данные, откройте исходное изображение. Затем откройте файл сетки массива. Выровняйте сетку массива по изображению сканирования с помощью мыши или клавиш со стрелками на клавиатуре компьютера.

Выберите выбор quantify в специальном программном обеспечении, которое создает файл считывания, содержащий интенсивность сигнала для каждой точки, фоновое значение и соответствующую последовательность пептидов. Наконец, храните микрочип запечатанным в темноте при температуре четыре градуса Цельсия под бескислородным азотом или газообразным аргоном. Здесь показано необработанное флуоресцентное изображение окрашивания микрочипа античеловеческим IgG после инкубации с конкретным образцом сыворотки вируса Зика, разбавленным в соотношении 1:250.

Контрольные пептиды ГК обрамляют микрочип. Пептиды, которые сильно реагируют на IgG, отображаются на панели увеличения. Аналогичным образом, здесь показано необработанное флуоресцентное изображение окрашивания микрочипа античеловеческим IgM после инкубации с конкретным образцом сыворотки вируса Зика, разбавленным в соотношении 1:250.

Опять же, контрольные пептиды ГК обрамляют микрочип. Пептиды, которые сильно реагируют на IgM, отображаются на панели увеличения. Здесь показана репрезентативная консенсусная последовательность эпитопов вируса Зика, реагирующая с IgM в пептидах образца сыворотки крови хозяина.

Пептиды из консенсусной последовательности эпитопов выделены красным цветом, а пептид с наибольшей интенсивностью флуоресценции — жирным. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как обрабатывать пептидный микрочип высокой плотности. После освоения этой техники ее можно выполнить за 24 часа, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить об осторожном обращении с микрочипом, чтобы не поцарапать поверхность микрочипа. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ИФА или поверхностный плазмонный резонансный анализ, чтобы определить, связываются ли идентифицированные пептиды специфически с антителами к вирусу Зика, а не с другими антителами к флавивирусу. После своего развития этот метод проложит путь исследователям в области диагностики к открытию диагностических пептидов с использованием образцов сыворотки и слюны.

Не забывайте, что работа с инфекционными агентами, такими как вирус Зика, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как тепловая инактивация образца сыворотки и работа в помещениях уровня биобезопасности 2.