Экспериментальный протокол для обнаружения митохондриальной функции в гепатоцитах, подвергшихся воздействию органохлорных пестицидов

Это messer, которые называют ответ на ключевой вопрос, который у вас есть в также функции области, такие как уровень АТФ и потребления кислорода. Новая или одна страница старая, этот метод является то, что это легко выполнить, и это много для специальной оценки клеточной митохондриальной функции. Чтобы начать этот эксперимент, семя 20 000 клеток HepG2 в стеклянном дне чашки Петри.

Добавить бета-гексахлорциклолексан или B-HCH в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и пять процентов CO2 в течение 24 часов. Подготовьте один миллимолярный митохондриальный зеленый раствор зонда флуоресценции, добавив ангидроус DMSO в среду культуры клеток DMEM. Затем добавьте один миллилитр на тарелку этого раствора в клетки в стеклянном дне чашек Петри.

И инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут. После инкубации удалите митохондриальный зеленый флуоресцентный раствор зонда из клеток. Добавить один миллилитр на блюдо свежеприготовленных при 37 градусах по Цельсию DMEM клеточной культуры среды.

Чтобы обнаружить зеленую флуоресценцию в митохондриях, наблюдайте за клетками под конфокальцатором. Для оценки уровней клеточного АТФ, семян до 20000 hepG2 клеток в шести пластин хорошо. Добавить бета-ГХГ и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов.

Добавьте 200 микролитров буфера лиза к клеткам в каждой хорошо. Центрифуга в 12 000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, и приступить к сбору супернатантов, как описано в текстовом протоколе. Добавьте к пластине буфер обнаружения АТФ 100 микролитров.

Добавьте 100 микролитров собранного клеточного супернатанта к пластине 96 хорошо при комнатной температуре и приступили к обнаружению клеточного АТФ с помощью люминометра, как описано в текстовом протоколе. Для оценки потенциала митохондриальной мембраны, расти HepG2 клетки в шести пластин хорошо с добавлением бета-ГХГ, как описано ранее. Соберите клетки, переваривая их с 0,5 миллилитров 0,25%EDTA в течение одной минуты при 37 градусов по Цельсию.

Добавьте один миллилитр DMEM, чтобы остановить пищеварение и перенести переваренные клетки в 1,5 миллилитровые трубки. Центрифуга труб при 1000 раз G в течение трех минут, а затем отказаться от супернатанта. Разбавить клеточной гранулы с 0,5 миллилитров клеточной культуры среднего и 0,5 миллилитров JC1 митохондриальной мембраны потенциального красителя.

И инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах по Цельсию. Далее центрифуга трубки при 600 раз G в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию, а затем мыть гранулы клетки в соответствии с текстовым протоколом. После центрифугирования промытой гранулы снимите супернатант.

И повторно приостановить гранулы в 0,5 миллилитров JC1 окраски буфера. Проанализируйте окрашенные клетки JC1 с помощью цитометрии потока для обнаружения зеленой и красной флуоресценции. При обнаружении мономера JC1 установите свет возбуждения до 490 нанометров, а свет излучения до 530 нанометров.

При обнаружении полимера JC1 установите свет возбуждения до 525 нанометров, а свет излучения - до 590 нанометров. Чтобы проанализировать скорость потребления кислорода, семенные клетки HepG2 в 96 хорошо клеточной культуры пластины в плотности 4500 клеток на 100 микролитров на колодец. После 24 часов инкубации при 37 градусах по Цельсию убедитесь, что клетки в каждой колодец покрыты средой.

Перед запуском программного обеспечения OCR загрузите микроплатформу картриджем и пластину культуры клеток во внеклеточный анализатор потока, как описано в текстовом протоколе. Откройте программное обеспечение OCR и в приложениях падение вниз меню, выбрать набор сотовой мито стресс-тест, и нажмите на кнопку запуска приложения. Далее нажмите кнопку стресс-теста.

Когда экран стресс-теста клетки появляется, введите количество клеток посева на колодец в поле номер посева клеток и средний OCR в среднем на базальной ячейки OCR поле. Введите окончательную рабочую концентрацию для каждого реагента, а затем введите реагенты. Нажмите на следующую кнопку.

Когда появится экран групповой информации, назначьте группу неподписанным колодцам, выбрав цвет и дав имя. Затем нажмите на соответствующие скважины. Нажмите на следующую кнопку и в экране макета инъекции стресс-теста, который появляется, нажмите на начало запуска стресс-теста на анализаторе.

После завершения запуска следуйте подсказкам в программном обеспечении, а затем удалите и отбросьте картридж и клеточную пластину. Средняя интенсивность митохондриального зеленого флуоресцентного окрашивания снизилась в клетках HepG2, подвергшихся воздействию бета-ГХГ. Это свидетельствует о снижении митохондриального числа и увеличении поврежденных митохондрий в соответствии с увеличением концентрации пестицидов.

Кроме того, уровни АТФ в клетках HepG2 снизились с увеличением концентрации бета-ГХГ воздействия, показывая снижение функции митохондрий в этих клетках. После JC1 окрашивания для митохондриального мембранного потенциала, или MMP, цитометр потока показал высокую красную зеленую флуоресценцию JC1 в нетронутых клетках HepG2. Это было связано с наличием красных флуоресцентных агрегатов JC1, которые являются признаком высокой MMP.

В клетках, обработанных бета-ГХГ, красная зеленая флуоресценция JC1 уменьшилась из-за присутствия зеленых флуоресцентных мономеров JC1, что является признаком низкого MMP. Наконец, уровень потребления кислорода также снизился с увеличением концентрации бета-ГХГ воздействия, что еще раз показывает, что этот пестицид ухудшает надлежащую митохондриальную функцию. О, ну, попытка этой процедуры, важно, хотя, чтобы помнить, чтобы увидеть, что клетки, как это уместно, чтобы проверить его.

После своего развития, это определенно прокладывает путь для исследований в области фундаментальной функции для изучения соответствующих организмов в медицинской роли, связанной с ним. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как обнаружить количество или качество, емкость, в настоящее время член или потенциал под носик лист функции.