Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя

Общая цель этой биослойной интерферометрии или анализа BLI заключается в измерении потенциального взаимодействия между очищенным белком ионного канала hEAG1 и низкомолекулярными липидами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фармакологии ионных каналов, например, может ли представляющая интерес малая молекула напрямую взаимодействовать с этим ионным каналом и какова кинетика взаимодействия? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является беструдным и высокопроизводительным методом.

Необходимо лишь небольшое количество обездвиженного белка. Как правило, люди, которые плохо знакомы с этим методом, будут испытывать трудности, потому что успешный анализ включает в себя несколько этапов, включая экспрессию белка, очистку, мечение, точно настроенный датчик и анализ данных. После культивирования HEK293 Т-клеток, экспрессирующих hEAG1, в течение двух-трех дней, соберите клетки, удалив питательную среду, и используйте четыре миллилитра PBS для промывания клеток дважды.

Откажитесь от PBS. Поместите клетки в два миллилитра PBS на чашку и используйте пипетку объемом один миллилитр для переноса в клетки в 15-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте клеточную суспензию при 420-кратном давлении и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Затем сцедите надосадочную жидкость и используйте четыре миллилитра буфера для лизиса для ресуспендирования гранулы. Инкубируйте суспензию на льду в течение 30 минут, тщательно переворачивая лизат каждые 10 минут. Затем центрифугируйте лизат клетки при давлении в 12 000 раз сильнее и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем переложите надосадочную жидкость в пятимиллилитровую трубку и держите ее на льду для немедленного использования. Для приготовления смолы anti-FLAG M2 affinity тщательно суспендируйте смолу путем мягкой инверсии, чтобы убедиться, что флакон геля anti-FLAG M2 представляет собой равномерную суспензию гелевых шариков. Сразу же перелейте 400 микролитров суспензии в охлажденную 1,5-миллилитровую трубку.

Затем центрифугируйте суспензию при давлении в 8 000 раз сильнее и четырех градусах Цельсия в течение 30 секунд и осторожно выбросьте надосадочную жидкость, чтобы смыть буфер для хранения. Чтобы ресуспендировать гранулу смолы, добавьте в смолу 500 микролитров надосадочной жидкости из экстракта белка и переложите суспензию в новую, охлажденную, пятимиллилитровую пробирку. Внесите пипеткой еще 500 микролитров белкового экстракта в исходную пробирку, чтобы собрать оставшиеся шарики, и перенесите экстракт в пятимиллилитровую пробирку.

Инкубируйте смесь в шейкере при восьми оборотах в минуту и четырех градусах Цельсия в течение ночи, чтобы связать гибридный белок FLAG со смолой. Затем центрифугируйте смесь при давлении в 1000 раз сильнее при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу три раза 500 микролитрами одного х PBS.

Держите его на льду для немедленного использования. Добавьте 10 микролитров трех растворов для элюирования FLAG к 390 микролитрам PBS для получения конечной концентрации 200 нанограмм на микролитр. Затем добавьте 400 микролитров трех растворов для элюирования FLAG в ранее подготовленные гелевые шарики.

Инкубируйте образец в встряхивающем инкубаторе при восьми оборотах в минуту и четырех градусах Цельсия в течение двух часов. Затем центрифугируйте смолу при 8000-кратном давлении в течение 30 секунд. Переложите надосадочную жидкость в свежую 1,5-миллилитровую тубу и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия для немедленного использования.

Используйте анализ белка БЦА в соответствии с инструкциями производителя для определения концентрации очищенного белка. Затем используйте образец объемом 30 микролитров для анализа вестерн-блоттинга с антителом против Flag, чтобы подтвердить, что интересующий белок был очищен. Чтобы маркировать очищенный белок биотином, приготовьте пять миллиграммов на миллилитр стокового раствора биотина в PBS.

Для каждого теста двух биосенсоров добавляют трехкратный молярный избыток биотина к 20 мкг очищенного белка для достижения предпочтительного N-концевого биотинилирования очищенного белка в PBS. Инкубируйте образец в темноте на льду не менее 30 минут. Чтобы удалить несвязанный биотин и буфер, обменяйте белок на SD-буфер.

Перенесите белок в устройство для ультрафильтрации с молекулярным отсечкой в 30 килодальтон. Затем добавьте буфер SD и центрифугируйте образец при 12 000-кратном течении силы тяжести и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Извлеките ультрафильтрат из пробирки центрифуги.

Добавьте 200 микролитров SD-буфера в фильтрующее устройство и снова центрифугируйте образец. Повторите процесс не менее трех раз. Соберите обмененный буфер образец, перевернув фильтрующее устройство, и поместите его в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Центрифугируйте образец при температуре в 2 000 раз сильнее и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Держите образец на льду для немедленного использования. Чтобы провести анализ BLI, за 30 минут до исследования предварительно прогрейте оборудование, включив прибор.

Перед началом работы проверьте окно состояния прибора, чтобы убедиться, что машина находится в состоянии готовности. Перед открытием программного обеспечения для сбора данных убедитесь, что дверца прибора закрыта, и в мастере экспериментов выберите «Новый кинетический эксперимент». Определите скважины, которые будут использоваться на пластине 96 лунок, щелкнув правой кнопкой мыши, чтобы выбрать буфер, нагрузку и образец.

Для пробных скважин единица концентрации PIP2 должна быть введена в виде моляров. Чтобы определить этапы анализа, выберите шаг и дважды щелкните по соответствующему столбцу. Для контрольных датчиков устанавливается дубликат определения пробирного анализа.

Установите частоту вращения в минуту на 1 000. Выберите одну минуту для базового шага и от пяти до 10 минут для загрузки, ассоциации и диссоциации соответственно. Проведите тест при комнатной температуре.

Нажмите на столбцы, содержащие датчики, и нажмите кнопку «Заполнить», чтобы указать расположение датчиков в лотке датчиков. Просмотрите все запланированные шаги, чтобы проверить наличие ошибок и вернуться к их исправлению. Во всей операции по анализу BLI этап пересмотра всех запланированных этапов может быть проигнорирован исследователем.

Тем не менее, очень важно проверить, что все запланированные шаги выполнены правильно. Установите расположение файлов данных и нажмите «Перейти», чтобы начать анализ. Запустите анализ и проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом.

Как видно из этого эксперимента с патч-хомутом в Т-клетке HEK293, стабильно экспрессирующей hEAG1, зависящие от напряжения внешние калиевые токи позволяют предположить, что функциональные каналы hEAG1 высоко экспрессируются в клетках. Использование антитела против FLAG этого вестерн-блоттинга hEAG1 из образцов очищенного белка указывает на качество и специфичность очищенного белка. Очищенный белок канала биотинилировали для проведения анализа взаимодействия с липидом PIP2 с использованием анализа BLI в реальном времени.

Здесь показана типичная кривая связывания между hEAG1 и PIP2. hEAG1 связывается с PIP2 в зависимости от концентрации. Накопленные концентрации PIP2 соответствуют следам данных биосенсора.

Этот репрезентативный анализ показывает изменения оптической интерференции при различных концентрациях PIP2. Наконец, кривая, соответствующая уравнению Хилла, была получена из пикового значения сигнала оптической интерференции, измеренного при различных концентрациях PIP2, и определены константы равновесной диссоциации между hEAG1 и PIP2. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за час, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру очень важно не забыть о пересмотре всех запланированных шагов, чтобы убедиться в правильности этой процедуры. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как патч-зажим, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как определение функции этого ионного канала после связывания малой молекулы. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области скрининга лигандов ионных каналов к изучению новых лигандов в открытии лекарств на ионных каналах.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как приготовить белок ионного канала и как проверить его взаимодействие с малыми молекулами, с помощью метода BLI.