4.11: Ультрацентрифугирование с градиентом плотности

Ультрацентрифугирование с градиентом плотности является распространенным методом, используемым для выделения и очистки биомолекул и клеточных структур. Этот метод использует тот факт, что в суспензии частицы, которые более плотные, чем растворитель, будут осаждаться, в то время как менее плотные частицы будут плавать. Высокоскоростная ультрацентрифуга используется для ускорения этого процесса, чтобы отделить биомолекулы в пределах градиента плотности, который может быть получен путем наслоения жидкостей с уменьшающейся плотностью в центрифужной пробирке.

В видеоролике будут рассмотрены принципы ультрацентрифугирования с градиентом плотности, в том числе процедура, демонстрирующая подготовку образцов, создание градиента сахарозы, ультрацентрифугирование и сбор фракционированных аналитов. В разделе «Приложения» обсуждаются выделение многобелковых комплексов, выделение комплексов нуклеиновых кислот и разделение с использованием градиентов плотности хлорида цезия.

Ультрацентрифугирование с градиентом плотности является распространенным подходом к выделению и очистке клеточных структур для биохимических экспериментов. В этом методе используется высокоскоростная центрифуга для неразрушающего разделения клеточных компонентов в градиенте плотности. В этом видео описываются принципы ультрацентрифугирования с градиентом плотности, приводится общая процедура использования градиента сахарозы и обсуждаются некоторые области применения.

Давайте начнем с изучения принципов работы ультрацентрифуг и градиентов плотности. Суспензия содержит частицы в жидком растворителе. Из-за силы тяжести частицы плотнее растворителя выводятся наружу, в то время как частицы менее плотные, чем растворитель, всплывают. Чем больше разница в плотности между частицей и растворителем, тем быстрее происходит разделение.

Ультрацентрифуга содержит узел, называемый ротором, который вращается с высоко контролируемой скоростью, имитируя сильное гравитационное поле. В пределах этой области разница в плотности между частицами и растворителем увеличивается.

Прочность поля зависит от скорости вращения. Даже небольшой ротор при относительно низкой скорости вращения может создать силу, в тысячи раз превышающую гравитационное поле Земли.

Если пробирка содержит несколько жидкостей разной плотности, центрифугирование будет удерживать их отдельными слоями в порядке плотности, причем самая плотная жидкость будет находиться ближе всего к основанию. Такое наслоение нескольких жидкостей называется «градиентом плотности». Существует два типа. В ступенчатых градиентах жидкости с убывающей плотностью аккуратно наслаиваются друг на друга. При непрерывных градиентах жидкости смешиваются в различных пропорциях, поэтому плотность плавно уменьшается от основания вверх.

Клеточные органеллы могут быть разделены с помощью ступенчатого градиента с помощью «изопикнического центрифугирования с градиентом плотности». Это самая простая и распространенная процедура центрифугирования.

Эта процедура используется для разделения клеточных структур. Чем плотнее органелла, тем дальше она опускается вниз – с митохондриями наверху и нуклеиновыми кислотами внизу.

Теперь, когда вы знаете принципы, лежащие в основе этой техники, давайте посмотрим на нее в лаборатории.

Перед началом процедуры следует отметить показатели скорости и плотности производителя, а также проверить ультрацентрифугу на коррозию. В этой процедуре используется ротор с качающимся ковшом.

Во-первых, клеточный материал подготавливается путем гомогенизации клеток, что неразрушающим образом высвобождает их органеллы. Гомогенат может быть фракционирован с помощью предварительного низкоскоростного центрифугирования для удаления компонентов с низкой плотностью. Далее готовятся растворы сахарозы.

Сахароза добавляется во все больших количествах, чтобы каждый раствор был более концентрированным и, следовательно, более плотным, чем предыдущий. Точная плотность растворов будет зависеть от компонентов, подлежащих разделению, которые варьируются в зависимости от организма. Растворы должны иметь плотность между плотностями компонентов, подлежащих разделению, причем последний раствор должен быть плотнее самого плотного компонента анализируемого вещества. Методы разделения компонентов, более плотных, чем сахароза, таких как нуклеиновые кислоты, описаны в приложениях.

Градиент сахарозы теперь создается в чистой центрифужной пробирке. Пипетка используется для набора максимально концентрированного раствора сахарозы. Когда трубка находится в вертикальном положении, наконечник пипетки помещается высоко к стене, и жидкость равномерно распределяется вниз. Важно, чтобы рабочая зона была свободна от вибраций и других помех.

После замены наконечника остальные растворы добавляются в порядке убывания плотности. Они аккуратно дозируются, чтобы образовать четкие слои и избежать смешивания. Наконец, около половины миллилитра клеточного образца добавляется поверх градиента, и трубка взвешивается. Это используется для балансировки распределения веса, следующего этапа процесса.

Центрифугирование должно начаться как можно скорее. Трубка помещается в ротор, который затем уравновешивается путем размещения заготовительных растворов равного веса в противоположных пазах. Ротор помещается в ультрацентрифугу, а система герметизируется. Задается температура, скорость вращения и время. Типичные значения равны 4 ? C с усилием более 100 000 x g в течение 16 ч.

После центрифугирования трубку извлекают из ротора, следя за тем, чтобы она оставалась в вертикальном положении и не нарушалась. Различные клеточные компоненты разделились на дискретные полосы между слоями раствора. Фракции можно собирать с помощью шприца. В качестве альтернативы дно пробирки можно проколоть тонкой стерилизованной иглой, а отток собрать в стерильные пробирки. В настоящее время клеточные компоненты изолированы. Они могут храниться при температуре -80 °C.

Теперь, когда мы рассмотрели основную процедуру, давайте рассмотрим некоторые приложения.

Типичным применением является выделение мультибелковых комплексов в растительных клетках. В этом примере комплексы, ответственные за циклический поток электронов, выделяются из тилакоида, места световой реакции в фотосинтезе. В этой процедуре используются дискретные растворы от 14 до 45% сахарозы. Центрифугирование происходит при давлении более 100 000 x g в течение 14 ч при 4 °C.

Поскольку нуклеиновые кислоты плотнее сахарозы, изопикнное центрифугирование не может отделить их от органелл неразрушающим способом.

Используется другой метод, известный как «скоростно-зональное центрифугирование». Он разделяет органеллы на основе скорости их оседания, которая зависит не только от их плотности, но и от их конформаций. Непрерывный градиент используется для разделения компонентов на основе этого свойства.

Процедурные шаги аналогичны тем, которые применяются в изопикнических случаях. В этом примере комплексы РНК-рибосома выделяют с использованием непрерывного градиента от 5% до 20%, центрифугируют при 230 000 x g. Центрифугирование прерывается через несколько часов, чтобы предотвратить совместное осаждение.

Нити нуклеиновых кислот могут быть отделены друг от друга на основе плотности.

Это связано с тем, что нити, богатые гуанином и цитозином, плотнее, чем те, которые богаты аденином и тиамином. В этом случае градиент нельзя делать из сахарозы, потому что сахароза менее плотная, чем нуклеиновые кислоты. Вместо этого используются градиенты хлорида цезия, обычно от 1,65 до 1,75 г/мл, так как они имеют достаточную плотность и низкую вязкость.

Здесь мы видим, как ДНК планктона очищается с помощью непрерывного градиента хлорида цезия. Центрифугирование происходит при давлении более 1 000 000 x g в течение 18 часов под вакуумом.

Вы только что посмотрели видео JoVE об ультрацентрифугировании с градиентом плотности сахарозы. Теперь вы должны понять, как работает градиент плотности, как построить ступенчатый градиент, а также как загружать и работать с ультрацентрифугой. Спасибо за просмотр!