4.10: Фотометрическое определение белка

Измерение концентрации является фундаментальным этапом многих биохимических анализов. Фотометрическое определение белка основано на том факте, что чем больше в образце светопоглощающих веществ, тем меньше света будет проходить через него. Поскольку связь между концентрацией и поглощением является линейной, это явление может быть использовано для измерения концентрации в образцах, где она неизвестна.

В этом видео описываются основы фотометрического определения белков и знакомятся с анализом Брэдфорда и методом Лоури. Процедура, показанная в видео, будет охватывать типичный анализ по Брэдфорду. Охватываемые области применения включают прямое измерение очень малых объемов нуклеиновых кислот для определения концентрации и чистоты, определение эффективности связывания биомиметического материала и другой вариант фотометрического определения белка с использованием красителя Ремазола.

Определение концентрации белка в образцах является фундаментальным этапом во многих биохимических анализах. Фотометрическое определение может быть выполнено с небольшими размерами образцов. Чем больше в образце светопоглощающих веществ, тем меньше свет будет проходить через него. Это обеспечивает количественное измерение поглощающих веществ. Эти концепции настолько фундаментальны для науки, что статьи, в которых представлены два из этих методов, вошли в тройку самых цитируемых работ всех времен. В этом видео будут показаны концепции, лежащие в основе некоторых из наиболее распространенных методов фотометрического определения белка, как они выполняются и как анализируются собранные данные.

Фотометрическое определение белка основано на соотношении между концентрацией и поглощением света. Это известно как закон Бира-Ламберта, который гласит, что концентрация вещества, поглощающего свет, пропорциональна его поглощению.

Этот принцип лежит в основе всех фотометрических методов определения белков.

Для анализа прямой абсорбции измеряются значения абсорбции образцов неизмененного белка. Благодаря своим ароматическим боковым цепям остатки триптофана и тирозина дают самые высокие показатели поглощения на длине волны 280 нм.

Тем не менее, эти аминокислоты, которые являются двумя наименее часто встречающимися в белках, присутствуют в разных количествах в каждом белке, поэтому каждое определение уникально. Чтобы преодолеть это ограничение, были разработаны более сложные анализы, которые не зависят от этих аминокислот.

Одним из примеров является Брэдфордский анализ, в котором к образцу добавляется цветной краситель. Краситель, известный как Coomassie Blue, реагирует пропорционально — чем больше белка присутствует, тем больше связывается с красителем.

Затем определяют концентрацию белка путем измерения поглощения связанного красителя Coomassie Blue, который поглощает свет с длиной волны 594 нм. Тем не менее, анализ Брэдфорда является линейным в коротком диапазоне концентраций, поэтому перед анализом часто требуется разбавление.

Метод Лоури сочетает в себе реагент Биурет, щелочной раствор ионов меди, реагирующих с пептидными связями, и реагент Фолина-Чоколтеу, который окисляет остатки ароматических белков. Результирующее изменение цвета образца пропорционально концентрации белка.

Абсорбцию восстановленного реагента Фолина можно определить при длине волны 750 нм. Как и при прямом всасывании, каждый белок имеет уникальную реакцию и должен быть откалиброван для интересующего белка. Теперь, когда мы рассмотрели основные принципы, лежащие в основе некоторых из наиболее распространенных анализов, давайте рассмотрим, как выполняется прямая абсорбция и анализ по Брэдфорду.

Чтобы начать анализ прямого поглощения, спектрофотометр калибруется с помощью заготовки для определения нулевого поглощения. Подготовлены стандартные растворы для использования при построении калибровочной кривой. Затем в кювету добавляют аликвоту первого стандарта и помещают в спектрофотометр.

Затем регистрируется значение поглощения на длине волны 280 нм. Этот процесс повторяется для каждого стандарта, используя чистую кювету для каждого прогона. После завершения создается калибровочная кривая путем построения графика зависимости поглощения от концентрации. Наклон этой линии является молярным коэффициентом затухания, который связывает поглощение с концентрацией.

Далее неизвестный образец добавляется в кювету, и записывается значение поглощения. Поскольку анализ данных для различных методов фотометрического определения схож, мы рассмотрим это после того, как рассмотрим анализ Брэдфорда.

Здесь анализ белка Брэдфорда выполняется со стандартом BSA на 96-луночном планшете. Для начала подготовлены решения для складских запасов BSA.

Неизвестные растворы разбавляют деионизированной водой, чтобы гарантировать, что концентрации находятся в пределах диапазона анализа. В зависимости от набора, краситель Кумасси также может потребовать разбавления. Затем калибровочная кривая настраивается путем добавления стандартов BSA на 96-луночный планшет.

Деионизированная вода добавляется для достижения необходимой концентрации для создания стандартной кривой. Неизвестный образец следует добавлять в пластину в трех экземплярах, чтобы обеспечить точное измерение. Затем в каждую лунку добавляют краситель кумасси, перемешивая пипеткой.

Деионизированная вода добавляется в пустую скважину в качестве заглушки, чтобы измерить поглощение. После ожидания 5 мин для связывания красителя измеряют абсорбцию в планшете-ридере с длиной волны 590 нм.

Теперь, когда мы провели несколько анализов, давайте рассмотрим, как анализировать данные. Каждый фотометрический метод определения белка основан на законе Бера-Ламберта.

Измеренная поглощающая способность эталонов используется для создания калибровочной кривой, которая затем используется для определения концентрации неизвестных образцов. Эту кривую можно построить вручную, хотя более новые спектрофотометрические инструменты создадут калибровочную кривую после того, как все стандарты будут измерены. Эти системы также будут рассчитывать концентрацию белка по мере анализа неизвестных образцов.

Теперь, когда мы рассмотрели, как анализировать данные фотометрического определения белка, давайте рассмотрим некоторые способы использования этих процедур.

Принципы фотометрического определения белков также могут быть использованы для непосредственного измерения концентрации нуклеиновых кислот. Нанокапельный спектрофотометр принимает образцы очень малого объема на оптически активный пьедестал. Затем измеряется абсорбция, и система автоматически определяет концентрацию нуклеиновой кислоты. Поскольку белки и другие источники могут мешать измерениям, чистота образца определяется путем анализа коэффициентов поглощения от 260 до 280 нм и от 260 до 230 нм. Чистые нуклеиновые кислоты обычно дают соотношения примерно 1,8 и приблизительно 2,0 для ДНК и РНК соответственно.

Фотометрическое определение белков также может быть использовано в производстве биомиметических материалов, которые вдохновлены природой для вызова специфических клеточных реакций. Рекомбинантные адгезины связываются с гранулами полистирола для имитации прикрепления бактерий к клеткам-хозяевам. Брэдфордский анализ используется для определения эффективности связывания рекомбинантной адгезии к гранулам при производстве биомиметического материала.

Альтернативные фотометрические анализы белков могут быть использованы для обнаружения и характеристики белковых противомикробных препаратов. Краситель Remazol brilliant blue R ковалентно связывается с бактериями, убитыми при нагревании. Антимикробный белок инкубируется в окрашенном растворе. Затем образец центрифугируют, и с помощью микропланшетного спектрофотометра измеряют поглощение надосадочной жидкости на длине волны 595 нм. Повышенная абсорбция растворимым красителем, выделяемым в надосадочную жидкость из меченых бактерий, является количественным измерением ферментативной активности.

Вы только что посмотрели видео JoVE о фотометрическом определении белка. В этом видео описываются основные принципы фотометрического определения, рассматриваются общие процедуры для некоторых распространенных анализов и освещаются некоторые новые достижения в области технологий. Спасибо за просмотр!