4.4: Тандемная масс-спектрометрия

В тандемной масс-спектрометрии представляющая интерес биомолекула выделяется из биологического образца, а затем фрагментируется на несколько субъединиц, чтобы помочь выяснить ее состав и последовательность. Это достигается за счет использования масс-спектрометров последовательно. Первый спектрометр ионизирует образец и фильтрует ионы с определенным отношением массы к заряду. Затем отфильтрованные ионы фрагментируются и передаются во второй масс-спектрометр, где фрагменты анализируются.

В этом видео представлены принципы тандемной масс-спектрометрии, включая методы выбора массы к отношению и диссоциации. Также показана общая методика анализа биохимического соединения с использованием тандемной масс-спектрометрии с диссоциацией, вызванной столкновением. Раздел «Приложения» охватывает мониторинг реакции отбора, определение модификаций белка после трансляции и обнаружение уровня такролимуса в крови.

Тандемная масс-спектрометрия связывает воедино несколько этапов масс-спектрометрии, чтобы сначала выделить биомолекулу, а затем определить аспекты ее химического состава. Биомолекулы имеют крупные, сложные структуры, что затрудняет определение их молекулярного состава. Тандемная масс-спектрометрия выбирает интересующую молекулу, которая впоследствии фрагментируется на несколько субъединиц, что может помочь выяснить ее идентификацию и последовательность. В этом видео будут показаны концепции тандемной масс-спектрометрии, общая процедура и некоторые из ее применений в биохимии.

Тандемная масс-спектрометрия начинается с типичного масс-спектрометрии: с источника ионов, который преобразует образец в ионы, и масс-анализатора, который разделяет ионы на основе их отношения массы к заряду. Обычный масс-анализатор, квадруполь, пропускает только ионы с определенным соотношением, в то время как остальные врезаются в стержни аппарата. Виды, которым может проникнуть внутрь, называемые ионом-предшественником, представляют интерес и представляют интерес для биомолекул. Ион перемещается в столкновительную ячейку, обычно в другую квадруполь, где энергия прикладывается для фрагментации иона по предсказуемой схеме.

Эти фрагменты перемещаются в другой масс-анализатор, такой как времяпролетный анализатор, который отделяет эти «ионы продукта». Затем ионы продукта направляются в детектор, как в обычном приборе МС. В случае неизвестного белка результирующий спектр содержит многочисленные перекрывающиеся фрагменты, что затрудняет создание окончательной полной последовательности биомолекулы. Тем не менее, спектральная картина уникальна для данного белка. Аналитическое программное обеспечение сравнивает спектр с базой данных известных пептидных последовательностей, выявляя неизвестный белок из перекрывающихся фрагментов.

В зависимости от образца и желаемой степени фрагментации возможны несколько методов фрагментации. Характер фрагментации зависит от того, как передается энергия, ее количество и как она распределяется по иону-предшественнику. Энергия может передаваться с помощью нейтральных частиц, излучения или электронов. Используя нейтральные атомы, процесс, называемый диссоциацией, вызванной столкновением или CID, в первую очередь расщепляет пептидную связь между аминокислотами, идеально подходящую для их идентификации.

Теперь, когда мы разобрались с основами метода, давайте посмотрим на тандемную масс-спектрометрию CID, используемую для изучения компонента оболочек бактериальных клеток.

Как и во всех масс-спектрометрических экспериментах, первым шагом является ионизация образца. Для биомолекул это обычно делается с помощью матричной лазерной десорбции или ионизации электроспреем. Затем ионный сигнал предшественника оптимизируется путем настройки ионной оптики. После этого цель изолируется и выбирается метод фрагментации, например CID.

Сила приложенного напряжения, которое ускоряет ион-предшественник в ячейке столкновения, влияет на степень фрагментации. Это напряжение увеличивается до тех пор, пока содержание прекурсора не составит примерно 10% по сравнению с ионом с наибольшим продуктом. Несколько спектров регистрируются и усредняются до тех пор, пока не будет достигнуто достаточное соотношение сигнал/шум. Количество необходимых сканирований зависит от интенсивности сигнала исходного иона-предшественника и может варьироваться от 3 до 300.

Аналит в этом примере, липид А из Escherichia coli K-12, имел 19 основных фрагментов после CID. Общая структура липида А хорошо известна, что позволяет программному обеспечению реконструировать конкретный состав по образцу.

Теперь, когда мы рассмотрели процедуру, давайте рассмотрим некоторые способы использования тандемной масс-спектрометрии в биохимии.

Распространенным режимом сканирования в тандемной масс-спектрометрии является выбранный мониторинг реакции, или SRM. В SRM оба масс-анализатора фиксируются на выбранном соотношении массы к заряду, фокусируясь на конкретных ионах-прекурсорах и продуктах. Благодаря высокой степени чувствительности SRM, спектры пептидных стандартов известных концентраций могут быть использованы и сравнены с спектрами неизвестных образцов, что позволяет количественно определить интересующие их белки.

Белки обычно модифицируются после трансляции, как правило, путем добавления функциональных групп, таких как метильные группы, фосфатные группы или сахара, известные как гликаны. Они играют важную роль в клеточных сигнальных процессах, выясняя, как клетки взаимодействуют друг с другом. Поскольку тандемная масс-спектрометрия фрагментирует белки на более мелкие компоненты, можно определить местоположение ПТМ по отношению к конкретному фрагменту или даже аминокислоте. Некоторые модификации, такие как ацетилирование и триметилирование, трудно дифференцировать только по массе, поэтому перед масс-спектрометрией проводится хроматографическое разделение.

Многие аналиты в крови пациента обнаруживаются в концентрациях ниже предела обнаружения для типичной масс-спектрометрии. Еще одним преимуществом SRM является то, что он отбрасывает все ионы продукта, кроме одного, увеличивая чувствительность и увеличивая нижний предел обнаружения до 100 раз. В этом примере иммунодепрессантный препарат, такролимус, может быть обнаружен на уровне 1 нг/мл.

Вы только что посмотрели видео JoVE о тандемной масс-спектрометрии. В этом видео описывалась теория инструмента, рассматривалась общая процедура и объяснялись некоторые способы использования этого метода в настоящее время. Спасибо за просмотр!