Сочетая анализов количественных пищи и насильно активации нейронов для изучения аппетит у дрозофилы

Общая цель этой процедуры заключается в количественном измерении потребления пищи взрослой дрозофилой, что дает возможность оценить эффекты генетических манипуляций, таких как термогенетическая и оптогенетическая активация нейронов. Эти меры могут помочь ответить на ключевые вопросы в области питания, такие как нейромеханика голода, сытости и аппетита. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он одновременно количественно оценивает потребление пищи несколькими группами мух, что делает его особенно полезным для идентификации аномально питающихся мух в генетических скринингах.

Для начала соберите припасы, чтобы подготовить внешнюю емкость. Суспензируйте 0,5 грамма агарозы и 50 миллилитров дважды дистиллированной воды. Нагревать при частом помешивании, и кипятить до полного растворения на магнитной мешалке с нагревательной пластиной.

Когда 1%-ная агароза остынет примерно до 60 градусов по Цельсию, перелейте пять миллилитров в пустой наружный контейнер и держите контейнер открытым, пока агароза не остынет до комнатной температуры, чтобы получилась агарозная прокладка. Далее добавьте 0,5 грамма агарозы в 50 миллилитров дважды дистиллированной воды. Нагревать при частом помешивании и кипятить до полного растворения на магнитной мешалке с нагревательной пластиной.

Когда 1%-ная агароза остынет примерно до 60 градусов по Цельсию, добавьте в агарозу 1,71 грамма сахарозы, чтобы получить 100 миллимоль сахарозы. Добавьте 0,25 грамма синего красителя в раствор агарозы, чтобы получить 0,5% веса на объем окрашенного продукта с маркировкой. Затем подготовьте внутреннюю емкость.

Пустые внутренние емкости поставьте на ровную горизонтальную поверхность. Затем добавьте 750 микролитров синего красителя с маркировкой продуктов в индивидуальные пищевые контейнеры. Дайте застыть не менее пяти минут.

Переложите заполненный внутренний контейнер в подготовленный внешний контейнер и расположите его в центре агарозной прокладки. Подготовьте камеры кормления с кормом без красителей для фонового вычитания. Оставьте камеры кормления открытыми при комнатной температуре на 40 минут, пока стенка наружного контейнера не освободится от конденсата.

Перед поведенческими экспериментами уравновесьте подготовленные камеры кормления при экспериментальной температуре 30 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы обеспечить относительно равномерную температуру в камерах кормления. Чтобы начать процесс кормления, осторожно переложите 20 мух из их домашнего флакона в предварительно нагретую камеру кормления легкими постукиваниями. Продолжайте процесс кормления при температуре 30 градусов Цельсия в течение 60 минут.

Прекратите кормление, заморозив камеры кормления при температуре минус 80 градусов Цельсия на 30 минут. Осторожно переложите 20 мух из одного флакона в камеру подачи легкими постукиваниями. А затем поставьте камеру боком на осветительную установку.

Для оптогенетических манипуляций используйте массив оранжевых светодиодов в качестве источника световой стимуляции и закрепите горизонтальную пластину из плексигласа над светодиодами для поддержки камер кормления во время освещения. Держите установку в инкубаторе при температуре 25 градусов Цельсия и влажности 60%. Стимулируют генетический контроль мух параллельно с УАС Taotie-GAL4 CsChrimson, но в разных камерах кормления.

Продолжайте процесс кормления в течение 60 минут при подсветке спины оранжевым светом. Затем заморозьте камеры подачи при температуре минус 80 градусов Цельсия на 30 минут. После прекращения кормления высыпьте всех 20 мух из камеры кормления на лист бумаги для взвешивания.

Затем переложите их в тубу объемом 1,5 миллилитра с помощью мягкой щетки. Добавьте в трубку 500 микролитров PBST и гомогенизируйте мух с помощью мельницы при частоте 60 герц в течение пяти секунд. Затем подтвердите достаточную гомогенизацию путем наблюдения, когда нет обнаруживаемых фрагментов частей тела.

Вращайте пробирки с гомогенатами в течение 30 минут при 1300 об/мин, чтобы очистить их от мусора. После центрифугирования перелейте 100 микролитров надосадочной жидкости в лунку 96 луночного планшета. Чтобы избежать неправильного расчета абсорбентов, вызванного мусором, осторожно выньте использованную пробирку из центрифуги и осторожно опустите надосадочную жидкость, не потревожив поддон.

После того, как все образцы загружены, поместите пластину в считыватель пластин, чтобы измерить абсорбенты образцов на 630 нанометрах. Реакцию на кормление количественно оценивали путем визуального осмотра и подсчета мух с обнаруживаемым красителем в кишечнике. После активации нейронов Taotie около 58% мух Taotie dTRPA1 продемонстрировали сильное пищевое поведение.

И 23% из них показали мягкое пищевое поведение. Остро активированные нейроны Taotie-GAL4 TRPA1 резко увеличивали потребление пищи, что позволяет предположить, что меченые Taotie-GAL4 нейроны участвуют в регуляции потребления пищи взрослыми дрозофилами. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как количественно оценить количество потребляемой пищи после манипулирования активностью нейронов для исследования нейромеханизмов контроля питания у взрослых дрозофил меланогастер.