Метод совместного культуры расследовать перекрестных помех между рентгеновского облученных клеток Caco-2 и КСДОР

Общей целью данного протокола кокультуры является измерение влияния ионизирующего излучения на проницаемость монослоя эпителиальных клеток Caco-2 и функцию плотного соединения в присутствии или отсутствии мононуклеарных клеток периферической крови. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области радиационной биологии и радиоиммунотерапии о возможных синергетических эффектах между воздействием ионизирующего излучения и функциями иммунных клеток. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что различные стимулы и популяция клеток могут быть протестированы и наблюдаемы в отрыве от них с помощью специальных дополнительных измерений.

Лучевые процедуры направлены на изучение монослоя клеток Caco-2 при облучении объема опухоли соответствующим пучком и точной дозиметрией, как это имеет место при лучевой терапии у пациента. За неделю до их облучения засейте клетки Caco-2 пять раз по 10-ю до пятой: в двух миллилитрах полной среды в одну стерильную культуру с диаметром пор и диаметром пор один микрометр вставить в лунку в шестилуночный планшет для культивирования клеток. Добавьте три миллилитра свежей готовой среды в нижний отсек каждой лунки и поместите клетки в инкубатор для увлажненных клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на семь дней.

В последний день инкубации добавьте 25 миллилитров Фиколла в 50 миллилитровую коническую трубку. И аккуратно нанесите 25 миллилитров свежесобранной цельной крови на Фиколл. Разделите ячейки с помощью центрифугирования с градиентом плотности.

И используйте пастеровскую пипетку для переноса мононуклеарных клеток периферической крови или PBMC на границе раздела в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров. Затем промыть изолированный PBMC в двух 10-миллилитровых стирках PBS. И культивировать ПБМК в свежей готовой среде не более трех-пяти часов в инкубаторе для клеточных культур.

Установите энергию фотонных рентгеновских лучей на пик в шесть мегавольт. И поместите культуру клеток Caco-2 на лист оргстекла толщиной 1,4 сантиметра в пределах траектории рентгеновских лучей и на расстоянии 100 сантиметров от источника излучения. Затем поместите на каждый образец болюс толщиной 0,57 сантиметра, чтобы гарантировать равновесие компонента обратного рассеяния излучения и заряженных частиц.

И используйте плоское и симметричное поле излучения 20 на 20 квадратных сантиметров и мощность дозы три грей в минуту для облучения клеток. Для оценки метаболической активности и жизнеспособности клеток Caco-2 в каждую лунку 24-луночного планшета за 24 часа до их облучения в 1,25 мл полной среды проводят посев 2 раза по 10 до пятой части клеток Caco-2. Затем верните клетки в инкубатор для клеточных культур на 21 час.

На следующий день добавьте в каждую лунку по 100 микролитров по пять миллиграммов на миллилитр раствора МТТ и инкубируйте клетки еще три часа. После промывки ячеек одним миллилитром PBS добавьте 500 микролитров диметилсульфоксида в каждую лунку, чтобы растворить любые кристаллы формазана, выделяемые клетками Caco-2, и оцените абсорбцию с помощью многолуночного планшетного ридера при лямбде 570 нанометров. Чтобы оценить жизнеспособность клеток Caco-2, промывайте клетки одним миллилитром PBS на лунку с последующей отделением клеток 100 микролитрами раствора Trypsin-EDTA в течение двух минут при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

Остановите реакцию с помощью 500 микролитров готовой среды и перенесите клетки в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров для центрифугирования. Ресуспендируйте гранулы в 50 микролитрах PBS на пробирку и смешайте полученные клеточные суспензии с равным объемом раствора красителя жизнеспособности Trypan Blue. Через три минуты при комнатной температуре подсчитайте количество жизнеспособных неокрашенных и нежизнеспособных окрашенных клеток в гемоцитометре.

Для оценки трансэпителиального электрического сопротивления или ТЭР клеток Caco-2 сразу после облучения перенос половины клеточной культуры Caco-2 вставляют в новую пластину с тремя миллилитрами свежей полной среды в каждую лунку, а половину вводят культур в новую пластину, засевают с двух до 10 до шестой PBMC на три миллилитра полной среды на лунку. Затем поместите электрод палочки для еды TEER во вставку для клеточной культуры каждый час в течение первых шести часов, а затем каждые три часа до 48 часов после облучения. Для вестерн-блоттинга через 48 часов после их облучения лизируют клетки Caco-2 и PBMC в дозе 40 мкм на 10 до шестой клетки буфера для лизиса клеток.

При лизисе и соскабливании клеток Caco-2 следите за тем, чтобы не отсоединить пористую мембрану от вставки, что может привести к потере клеточного лизата и смещению результата. Храните лизированные образцы клеток при температуре минус 20 градусов Цельсия. После количественного определения общего количества белка в каждом образце лизиса клеток методом бицинхониновой кислоты добавьте равные объемы буфера для образца Laemmli, дополненного бета-меркаптоэтанолом, к каждому образцу общего белка в отдельных микроцентрифужных пробирках.

Нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем соберите денатурированные белки центрифугированием и загрузите равные общие объемы белка из каждого образца в сборный гель от четырех до 20%. Запустите образцы в течение одного часа при напряжении 120 вольт.

Затем используйте полусухую электрическую систему переноса для переноса белков на мембрану из поливинилиденфторида. Затем поместите мембрану в контейнер и заблокируйте неспецифические места связывания 5% обезжиренным сухим молоком в PBS с добавлением 0,2% Tween 20 в течение 60 минут при комнатной температуре с легким перемешиванием. В конце блокирующей инкубации трижды промыть мембрану 10 миллилитрами 0,2% PBS Tween 20 в течение пяти минут за промывку и пометить мембрану соответствующими первичными антителами, представляющими интерес, в течение одного часа при комнатной температуре с легким перемешиванием.

После ночной инкубации при четырех градусах Цельсия при осторожном перемешивании промывайте мембрану три раза 0,2%-ным PBS Tween 20, как только что продемонстрировано, и инкубируйте мембрану соответствующими конъюгированными вторичными антителами к пероксидазе хрена в течение 60 минут при комнатной температуре с легким перемешиванием. После трех промывок PBS инкубируйте мембрану с помощью набора с усиленным хемилюминесцентным раствором. Затем нанесите изображение полученной пленки с помощью соответствующей системы сканирования и количественно оцените результаты с помощью подходящей программы анализа изображений.

Облучение до 10 грей не изменяет метаболическую активность клеток Caco-2 через 24 или 48 часов после облучения, хотя жизнеспособность клеток со временем снижается при обеих дозах. Оценка TEER некокультивируемых клеток Caco-2 после воздействия двух грей облучения показывает стабильные значения TEER в течение 48 часов после облучения. Однако после 10 грей облучения клетки демонстрируют длительное снижение TEER, начиная с трех часов после облучения.

Кокультура с PBMC приводит к снижению TEER, которое очевидно через три часа после облучения в обеих дозах до 30 часов после облучения, когда значения TEER, по-видимому, остаются относительно постоянными. Вестерн-блоттинг белков плотных соединений не выявил различий в экспрессии Claudin-1 или окклюдина в ответ на облучение и/или кокультуру PBMC, в то время как в различных белках скаффолда наблюдаются большие флуктуации. Кроме того, общий белок NF-каппа B не изменяется ни при одной из доз облучения, в то время как уровень белка XIAP повышается в четыре раза при обеих дозах.

Используя эту процедуру, можно добавить другие биологические стимулы, такие как энтеробактерии, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как различные биологические стимулы могут изменить реакцию хорошего монослоя на воздействие ионизирующего излучения. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как измерить влияние ионизирующего излучения и иммунных клеток на проницаемость клеток Caco-2 и экспрессию комплекса плотных переходов.