4.3: MALDI-TOF Масс-спектрометрия

Матричная лазерная десорбционная ионизация (MALDI) является масс-спектрометрическим источником ионов, идеально подходящим для анализа биомолекул. Вместо ионизирующих соединений в газообразном состоянии образцы встраиваются в матрицу, на которую наносится лазер. Матрица поглощает большую часть энергии; Часть этой энергии затем передается образцу, который в результате ионизируется. Затем ионы образцов могут быть идентифицированы с помощью времяпролетного анализатора (TOF).

В этом видео рассказывается о принципах работы MALDI-TOF, в том числе о выборе матрицы и о том, как TOF используется для выяснения соотношения массы к заряду. Эта процедура показывает подготовку планшета MALDI, загрузку образцов на планшет и работу TOF-масс-спектрометра. В заключительном разделе показаны варианты их применения, включая анализ целых клеток, определение характеристик сложных биологических образцов и ионизацию электронным напылением.

Матричная лазерная десорбционная ионизация, или MALDI, является масс-спектрометрическим источником ионов, идеально подходящим для анализа биомолекул. Большинство источников ионов удаляют структурную информацию из больших, хрупких биомолекул. MALDI сохраняет структурную целостность и, следовательно, информацию, ускоряя молекулы в масс-анализаторе, который разделяет соединения по размеру и заряду. Чаще всего с MALDI связан время полета, или TOF, масс-анализатор. В этом видео будут показаны концепции ионизации MALDI, общая процедура и некоторые из ее применений в биохимии.

Для функционирования масс-спектрометрии молекулы должны быть ионизированы до газообразного состояния. В MALDI образец встраивается в матрицу, обычно органическое соединение, содержащее ароматические и сопряженные двойные связи.

Когда лазерный импульс попадает на эту смесь, матрица поглощает большую часть энергии, быстро нагревается и десорбируется или высвобождается с поверхности. Заряженная матрица передает часть своей энергии биомолекулам, десорбируя и затем ионизируя их.

MALDI обычно работает в паре с масс-анализатором времени полета (TOF). Электрическое поле прикладывает кинетическую энергию к ионам, перемещая их в свободную от поля область, называемую дрейфовой трубкой. Скорость ионов при их движении по трубке связана с отношением их массы к заряду, поэтому более тяжелые частицы проходят через прибор медленнее. Детектор на конце трубки измеряет время полета каждого иона. Обладая этими знаниями, а также длиной трубки и приложенной напряженностью поля, можно выяснить отношение массы к заряду каждого иона.

Этот график зависимости интенсивности сигнала от отношения массы к заряду, известный как масс-спектр, можно сравнить с библиотекой собранных спектров. Если совпадения не найдены, молекулы могут быть идентифицированы с помощью других методов, таких как тандемная масс-спектрометрия. Для получения дополнительной информации посмотрите видео этой коллекции по этой теме.

Теперь, когда мы обсудили основы MALDI-TOF, давайте посмотрим на процесс в лаборатории.

Прежде чем начать эксперимент, важно продумать выбор матрицы, из которой будут десорбироваться образцы. Он должен поглощать энергию лазера, быть стабильным в вакууме, не вступать в реакцию с молекулами-мишенями и уметь десорбировать. В зависимости от образца предпочтение отдается различным матрицам. Для большого белка комбинация CHCA и DHB показала лучшее разделение пиков, называемое разрешением, чем отдельные матрицы.

Существует несколько способов подготовки образцов. Мы покажем то, что известно как «двухслойный» или «сэндвич» метод. Для начала очистите планшет MALDI сверхчистыми реагентами, так как масс-спектрометрия очень чувствительна к загрязнениям. Высушите пластину струей инертного газа.

Затем получают насыщенный матричный раствор, обычно с органическим растворителем. Раствор наносится на пластину MALDI и высыхает. Получают второй насыщенный раствор матрицы, содержащий трифторуксусную кислоту, или ТЖК. ТЖК помогает ионам переходить в газообразную фазу.

Далее раствор образца добавляется поверх высушенного пятна матрицы. Добавьте матричный раствор, содержащий ТФК, поверх образца, тем самым завершив матричный «бутерброд». Однородность пятна можно проверить под маломощным микроскопом.

Пластина калибровочного эталона, которая представляет собой смесь с широким диапазоном известных масс и используется для корреляции времени пролета с м/з. Наконец, поместите только матрицу в качестве отрицательного контроля.

Чтобы проанализировать пятна, поместите целевую пластину в прибор. Убедитесь, что в помещении нет мусора, что способствует образованию плотного вакуума. В программном обеспечении выберите стандартный, отрицательный контроль и интересующие пробы. Пометьте пятна правильной идентификацией.

Источником ионов и напряжением линзы можно манипулировать для повышения производительности анализа. Это будет зависеть от специфики прибора и образца. Сосредоточьтесь на стандартной точке и откалибруйте прибор с помощью программного обеспечения.

Затем соберите спектры из каждого из образцовых пятен. Попробуйте несколько разных мест на месте, чтобы максимально повысить качество собранных данных. После очистки пластину MALDI можно собрать и использовать повторно.

Теперь, когда мы рассмотрели процедуру, давайте рассмотрим некоторые способы использования MALDI и другую технику ионизации.

Помимо биомолекул, MALDI можно использовать для анализа живых клеток. Макрофаги — это иммунные клетки, которые принимают одну из нескольких различных форм в зависимости от их микроокружения. После воздействия на клетки различных сигнальных молекул или цитокинов, они могут быть добавлены непосредственно в планшет и проанализированы. Спектры MALDI могут быть использованы в качестве уникальных «отпечатков пальцев», в зависимости от используемого цитокина.

Сложные биологические образцы, такие как секрет сальных желез млекопитающих, требуют этапа очистки перед анализом MALDI. Тонкослойная хроматография является одним из таких методов, который основан на полярности компонентов. Соединения собирают из паштета TLC, очищают и переносят в матрицу MALDI. Полученные спектры проверяют идентичность и чистоту отделенных биомолекул от сальных выделений млекопитающих.

Еще одним распространенным источником ионов для биомолекул является ионизация электрораспылением, или ESI. При этом методе образец вводится в прибор, где подается высокое напряжение, создавая аэрозоль из заряженных капель. По мере того, как растворитель в капле испаряется, заряд перемещается к молекулам образца до тех пор, пока они полностью не станут газообразными. ESI не требует процедуры выделения, и образец может быть введен непосредственно в прибор. С другой стороны, ESI более чувствителен к присутствию буферных компонентов и других загрязняющих веществ, что означает, что MALDI более устойчив.

Вы только что посмотрели видео JoVE о масс-спектрометрии MALDI. В этом видео описывалась теория, лежащая в основе этого инструмента, рассматривалась общая процедура и рассматривались некоторые варианты использования этого метода. Спасибо за просмотр!