4.2: Ферментные анализы и кинетика

Кинетика ферментов описывает каталитические эффекты ферментов, которые представляют собой биомолекулы, способствующие химическим реакциям, необходимым для живых организмов. Ферменты воздействуют на молекулы, называемые субстратами, образуя продукты. Кинетические параметры фермента определяются с помощью анализов, которые прямо или косвенно измеряют изменения субстрата или концентрации продукта с течением времени.

В этом видео будут рассмотрены основные принципы кинетики ферментов (включая уравнения скорости) и кинетические модели. Также обсуждаются концепции, регулирующие ферментные анализы, за которыми следует типичный колориметрический анализ. В разделе «Приложения» обсуждается ферментативный анализ с помощью анализа резонансной передачи энергии (FRET) Фёрстера, характеризующий активность внеклеточных ферментов в окружающей среде и исследующий кинетику репарации ДНК с помощью молекулярных зондов.

Ферменты являются биохимическими катализаторами, которые необходимы для жизни. Ферментативные анализы используются для изучения кинетических свойств ферментативных реакций, выяснения каталитических эффектов ферментов. В этом видео будет рассмотрена кинетика ферментов и анализы, рассмотрена общая процедура и показаны некоторые области применения.

Ферменты — это белки или реже РНК, которые действуют на определенный реагент, называемый субстратом. Фермент снижает энергию активации, необходимую для начала биохимической реакции, в результате чего реакция протекает быстрее.

Ферментативные реакции можно разбить на три элементарных компонента. Первый – это образование ферментно-субстратного комплекса, образованного связыванием субстрата с активным центром фермента. Комплекс может разлагаться на исходные составляющие. Это вторая элементарная реакция. Как вариант, комплекс может образовывать продукт и восстанавливать фермент, в результате третьей элементарной реакции.

Кинетика элементарной реакции задается уравнением закона элементарной скорости. Уравнения закона скорости дают скорость в терминах концентрации реагентов и константы скорости. Каждая из элементарных реакций имеет индивидуальное уравнение закона скорости, со своей константой скорости. Эти уравнения могут быть сведены к кинетической модели, известной как уравнение Михаэлиса-Ментена. Это дает скорость реакции с точки зрения концентрации субстрата; которые можно определить экспериментальным путем. Некоторые общие тенденции ферментативных реакций можно определить с помощью уравнения Михаэлиса-Ментена. При высокой концентрации субстрата достигается точка насыщения, называемая Vmax. В этом случае скорость ограничена общей концентрацией фермента и количеством молекул субстрата, которые фермент превращает в продукт за определенное время, также известное как kcat. В кинетике Михаэлиса-Ментена kcat является одной из двух констант, определяющих скорость реакции. Другая константа, KM, известна как константа сродства. KM также эквивалентен концентрации, где скорость реакции эквивалентна половине Vmax . Фермент с более высоким сродством будет иметь более низкий KM и достигнет Vmax быстрее, в то время как фермент с более низким сродством будет иметь более высокий KM и ему потребуется больше времени, чтобы достичь Vmax. Знание kcat и KM позволяет сравнивать ферменты. Для этого мы используем соотношение, называемое эффективностью фермента. Более высокий kcat и более низкий KM приводят к более высокой эффективности, в то время как более низкий kcat и более высокий KM приводят к более низкому показателю.

Факторы, используемые для выяснения кинетики ферментов, должны быть определены экспериментально. Эти анализы обычно выполняются путем смешивания фермента и раствора субстрата в контролируемой среде. Наблюдения проводятся путем измерения изменений концентрации субстрата, продукта или побочных продуктов во времени.

Изменение концентрации с течением времени используется для определения скорости реакции. Для определения кинетики необходимо получить данные о скорости при нескольких концентрациях. Если график обратной начальной скорости в зависимости от обратной начальной концентрации, известный как график Лайнвивера-Берка, является линейным, то реакция следует кинетике Михаэлиса-Ментена. Наклон и пересечение линии позволяют определить кинетические параметры KM и Vmax, которые затем могут быть использованы для расчета kcat и эффективности фермента.

Теперь, когда мы обсудили принципы кинетики ферментов, давайте рассмотрим, как выполняется типичный ферментный анализ.

В этой процедуре демонстрируется колориметрический анализ. ? Первым шагом является построение стандартной кривой, которая будет коррелировать поглощение с концентрацией субстрата. Растворы известной концентрации готовят вместе с контрольным образцом. Раствор проявителя, который вступает в реакцию с подложкой, добавляется для получения цветного соединения. Поглощение измеряется и строится в зависимости от концентрации для создания стандартной кривой.

Для проведения анализа подготавливают известную концентрацию субстрата вместе с соответствующим количеством фермента. Фермент и субстрат смешивают и дают инкубироваться в течение установленного промежутка времени. pH и температура контролируются с помощью буферных растворов и нагревательных блоков. Для остановки реакции добавляется закалочный агент. Затем раствор проявителя добавляется в реакции и перемешивается. Затем растворы помещают в кюветы и измеряют абсорбцию. Количество потребляемой подложки определяется путем сравнения измеренной впитываемости со стандартной кривой. На основе собранных данных определяются начальные скорости реакции путем построения графиков концентрации во времени. Наконец, с помощью данных о скорости и концентрации строится график Михаэлиса-Ментена. Это позволяет определить кинетические свойства фермента, такие как число оборотов и эффективность фермента.

Теперь, когда мы рассмотрели процедуру анализа, давайте рассмотрим другие способы проведения анализов и их применение.

В этой процедуре анализ FRET используется для изучения кинетики протеазы, гидролизующей пептидную связь белка. Эти выбросы могут быть измерены, что позволяет проводить непрерывный количественный анализ потребления и производства субстрата, что помогает определить кинетику реакции.

Ферментные анализы могут быть использованы в науке об окружающей среде для определения уровней внеклеточной активности ферментов в окружающей среде. Вода, почва и отложения могут быть собраны из окружающей среды и обработаны в лаборатории. Внеклеточная ферментативная активность этих материалов может быть охарактеризована с помощью ферментных анализов. Это полезный инструмент для понимания того, как окружающая среда обрабатывает органический материал.

Механизм репарации ДНК клетки можно оценить, изучив кинетику ферментов, обнаруженных в ядре. Скорость, с которой фермент удаляет повреждения ДНК, может быть измерена с помощью флуоресцентных молекулярных маяков, которые флуоресцируют только при связывании с уникальными последовательностями ДНК. Уровень репарации ДНК можно измерить в режиме реального времени путем обнаружения флуоресцентно помеченных продуктов расщепления.

Вы только что посмотрели видео JoVE о кинетике ферментов и анализах. В этом видео объясняется кинетика ферментов, рассматриваются концепции анализа, рассматривается общая процедура и описываются некоторые области применения.

Спасибо за просмотр!