Ферментные анализы и кинетика
Кинетика ферментов описывает каталитические эффекты ферментов, которые представляют собой биомолекулы, способствующие химическим реакциям, необходимым…
Кинетика ферментов описывает каталитические эффекты ферментов, которые представляют собой биомолекулы, способствующие химическим реакциям, необходимым для живых организмов. Ферменты воздействуют на молекулы, называемые субстратами, образуя продукты. Кинетические параметры фермента определяются с помощью анализов, которые прямо или косвенно измеряют изменения субстрата или концентрации продукта с течением времени.
В этом видео будут рассмотрены основные принципы кинетики ферментов (включая уравнения скорости) и кинетические модели. Также обсуждаются концепции, регулирующие ферментные анализы, за которыми следует типичный колориметрический анализ. В разделе «Приложения» обсуждается ферментативный анализ с помощью анализа резонансной передачи энергии (FRET) Фёрстера, характеризующий активность внеклеточных ферментов в окружающей среде и исследующий кинетику репарации ДНК с помощью молекулярных зондов.
Ферменты являются биохимическими катализаторами, которые необходимы для жизни. Ферментативные анализы используются для изучения кинетических свойств ферментативных реакций, выяснения каталитических эффектов ферментов. В этом видео будет рассмотрена кинетика ферментов и анализы, рассмотрена общая процедура и показаны некоторые области применения.
Ферменты — это белки или реже РНК, которые действуют на определенный реагент, называемый субстратом. Фермент снижает энергию активации, необходимую для начала биохимической реакции, в результате чего реакция протекает быстрее.
Ферментативные реакции можно разбить на три элементарных компонента. Первый – это образование ферментно-субстратного комплекса, образованного связыванием субстрата с активным центром фермента. Комплекс может разлагаться на исходные составляющие. Это вторая элементарная реакция. Как вариант, комплекс может образовывать продукт и восстанавливать фермент, в результате третьей элементарной реакции.
Кинетика элементарной реакции задается уравнением закона элементарной скорости. Уравнения закона скорости дают скорость в терминах концентрации реагентов и константы скорости. Каждая из элементарных реакций имеет индивидуальное уравнение закона скорости, со своей константой скорости. Эти уравнения могут быть сведены к кинетической модели, известной как уравнение Михаэлиса-Ментена. Это дает скорость реакции с точки зрения концентрации субстрата; которые можно определить экспериментальным путем. Некоторые общие тенденции ферментативных реакций можно определить с помощью уравнения Михаэлиса-Ментена. При высокой концентрации субстрата достигается точка насыщения, называемая Vmax. В этом случае скорость ограничена общей концентрацией фермента и количеством молекул субстрата, которые фермент превращает в продукт за определенное время, также известное как kcat. В кинетике Михаэлиса-Ментена kcat является одной из двух констант, определяющих скорость реакции. Другая константа, KM, известна как константа сродства. KM также эквивалентен концентрации, где скорость реакции эквивалентна половине Vmax . Фермент с более высоким сродством будет иметь более низкий KM и достигнет Vmax быстрее, в то время как фермент с более низким сродством будет иметь более высокий KM и ему потребуется больше времени, чтобы достичь Vmax. Знание kcat и KM позволяет сравнивать ферменты. Для этого мы используем соотношение, называемое эффективностью фермента. Более высокий kcat и более низкий KM приводят к более высокой эффективности, в то время как более низкий kcat и более высокий KM приводят к более низкому показателю.
Факторы, используемые для выяснения кинетики ферментов, должны быть определены экспериментально. Эти анализы обычно выполняются путем смешивания фермента и раствора субстрата в контролируемой среде. Наблюдения проводятся путем измерения изменений концентрации субстрата, продукта или побочных продуктов во времени.
Изменение концентрации с течением времени используется для определения скорости реакции. Для определения кинетики необходимо получить данные о скорости при нескольких концентрациях. Если график обратной начальной скорости в зависимости от обратной начальной концентрации, известный как график Лайнвивера-Берка, является линейным, то реакция следует кинетике Михаэлиса-Ментена. Наклон и пересечение линии позволяют определить кинетические параметры KM и Vmax, которые затем могут быть использованы для расчета kcat и эффективности фермента.
Теперь, когда мы обсудили принципы кинетики ферментов, давайте рассмотрим, как выполняется типичный ферментный анализ.
В этой процедуре демонстрируется колориметрический анализ. ? Первым шагом является построение стандартной кривой, которая будет коррелировать поглощение с концентрацией субстрата. Растворы известной концентрации готовят вместе с контрольным образцом. Раствор проявителя, который вступает в реакцию с подложкой, добавляется для получения цветного соединения. Поглощение измеряется и строится в зависимости от концентрации для создания стандартной кривой.
Для проведения анализа подготавливают известную концентрацию субстрата вместе с соответствующим количеством фермента. Фермент и субстрат смешивают и дают инкубироваться в течение установленного промежутка времени. pH и температура контролируются с помощью буферных растворов и нагревательных блоков. Для остановки реакции добавляется закалочный агент. Затем раствор проявителя добавляется в реакции и перемешивается. Затем растворы помещают в кюветы и измеряют абсорбцию. Количество потребляемой подложки определяется путем сравнения измеренной впитываемости со стандартной кривой. На основе собранных данных определяются начальные скорости реакции путем построения графиков концентрации во времени. Наконец, с помощью данных о скорости и концентрации строится график Михаэлиса-Ментена. Это позволяет определить кинетические свойства фермента, такие как число оборотов и эффективность фермента.
Теперь, когда мы рассмотрели процедуру анализа, давайте рассмотрим другие способы проведения анализов и их применение.
В этой процедуре анализ FRET используется для изучения кинетики протеазы, гидролизующей пептидную связь белка. Эти выбросы могут быть измерены, что позволяет проводить непрерывный количественный анализ потребления и производства субстрата, что помогает определить кинетику реакции.
Ферментные анализы могут быть использованы в науке об окружающей среде для определения уровней внеклеточной активности ферментов в окружающей среде. Вода, почва и отложения могут быть собраны из окружающей среды и обработаны в лаборатории. Внеклеточная ферментативная активность этих материалов может быть охарактеризована с помощью ферментных анализов. Это полезный инструмент для понимания того, как окружающая среда обрабатывает органический материал.
Механизм репарации ДНК клетки можно оценить, изучив кинетику ферментов, обнаруженных в ядре. Скорость, с которой фермент удаляет повреждения ДНК, может быть измерена с помощью флуоресцентных молекулярных маяков, которые флуоресцируют только при связывании с уникальными последовательностями ДНК. Уровень репарации ДНК можно измерить в режиме реального времени путем обнаружения флуоресцентно помеченных продуктов расщепления.
Вы только что посмотрели видео JoVE о кинетике ферментов и анализах. В этом видео объясняется кинетика ферментов, рассматриваются концепции анализа, рассматривается общая процедура и описываются некоторые области применения.
Спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the three elementary reactions in an enzymatic reaction?
Enzymatic reactions consist of three elementary steps. First, the enzyme-substrate complex forms when substrate binds to the enzyme's active site. Second, the complex can decompose back into the enzyme and substrate. Third, the complex can form the product while recovering the enzyme for another catalytic cycle.
Q2: How do KM and kcat relate to enzyme efficiency?
Enzyme efficiency is determined by the ratio of kcat to KM. Higher kcat values and lower KM values result in higher enzyme efficiency, meaning the enzyme converts substrate to product more effectively. Conversely, lower kcat and higher KM produce lower efficiency, indicating slower or less effective catalysis.
Q3: What does the Lineweaver-Burk plot reveal about enzyme kinetics?
The Lineweaver-Burk plot graphs inverse initial rate versus inverse substrate concentration. If this plot is linear, the reaction follows Michaelis-Menten kinetics. The slope and intercept of the line allow researchers to determine KM and Vmax, which can then be used to calculate kcat and enzyme efficiency.
Q4: How is a standard curve generated in a colorimetric enzyme assay?
A standard curve is created by preparing substrate solutions of known concentrations along with a control sample. A developer solution is added to each, producing a colored compound proportional to substrate concentration. Absorbance is measured and plotted against concentration, creating a reference curve for determining unknown substrate amounts.
Q5: What is the purpose of the quenching agent in an enzyme assay procedure?
The quenching agent stops the enzymatic reaction at a specific time point, halting substrate conversion to product. This allows researchers to measure the exact amount of substrate consumed during the controlled incubation period, enabling accurate determination of reaction rates at different substrate concentrations.
Q6: How can enzyme assays be applied to environmental science?
Enzyme assays measure extracellular enzyme activity in environmental samples like water, soil, and sediments. By characterizing enzymatic activity in these materials, researchers can understand how the environment processes organic material and assess microbial metabolic capacity in natural ecosystems and environments.
Q7: What advantage does FRET analysis offer for studying enzyme kinetics?
Förster resonance energy transfer analysis enables continuous, real-time monitoring of enzymatic reactions. When a protease hydrolyzes a peptide bond, FRET emissions change measurably, allowing quantitative analysis of substrate consumption and product formation without stopping the reaction, providing more detailed kinetic data.