Перешнуровка частичное желчных протоков в мышь: контролируемые модель локализованных обструктивного холестаза
28 марта 2018 г.
Здесь мы представляем частичное желчных протоков лигирование как модель хирургической травмы печени и регенерации в грызунов.
Общей целью данного хирургического вмешательства является наблюдение за последствиями локализованного обструктивного холестаза. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гепатологии о том, как определить механизмы регенерации печени. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно проводить содержательные сравнения между лигированной экспериментальной долей и нелигированной контрольной долей у одного и того же животного.
Сегодня процедуру будет демонстрировать доктор Тосимаса Накао, постдок из лаборатории трансплантационной хирургии. После подтверждения отсутствия реакции на защемление пальца ноги у обезболенной 8-12-недельной мыши C57 black 6, побрейте брюшную область машинкой для стрижки волос и поместите животное под хирургический микроскоп. Закрепите конечности на столе и с помощью стерильных тампонов последовательно продезинфицируйте операционную область от 0,3 до 0,5 миллилитров повидон-йода и 70% этанола.
Затем сделайте разрез по средней линии от мечевидной кости к лобку и с помощью микроретрактора откройте брюшную полость. Используйте москитные щипцы, чтобы втянуть мечевидный кость к голове мыши, и используйте мягкую глину, чтобы удерживать щипцы и мечевидный кость в этом положении. Увлажните брюшную полость одним-двумя миллилитрами стерилизованного 37 градусов по Цельсию PBS и с помощью влажных ватных тампонов осторожно переместите тонкую кишку к голове мыши.
Разрежьте связки между тонкой кишкой и забрюшинным пространством, чтобы не повредить ткани, и оберните тонкую и толстую кишки влажной нетканой марлевой губкой. Поместите ткань кишечника на каудальную сторону брюшной полости и с помощью небольшой влажной нетканой марлевой губки аккуратно втяните всю печень к мечевидной кости, чтобы обнажить ворота печени и гепатодуоденальную связку. Найдите печеночный воротник, общий желчный проток на вентральной стороне воротной вены, а также левый и правый печеночные желчные протоки, которые впадают в главное билиарное слияние в печеночном воротнике.
Используя нейлоновый шов 10-0 и тупую сторону иглы для наложения швов, перевязать левую долю желчного протока печени. После наложения шва верните тонкую и толстую кишки в их анатомическое положение и подтвердите отсутствие перекрута кишечника или внутрибрюшного кровотечения. Затем снимите комариные щипцы, отдельно закройте мышечный и кожный слои сплошными швами 4-0 Викрилом, и поместите мышь под тепловую лампу с контролем до полного выздоровления.
Сравнение биохимии сывороточной печени у мышей, перевязанных частичным желчным протоком, и трансгенных мышей, перевязанных полным желчным протоком, для агрегации нерастворимых белков печени выявило минимальное повреждение печени или холестаз у мышей, перевязанных частичным желчным протоком, и тяжелое повреждение и накопление ферментов у трансгенных животных, перевязанных полным желчным протоком. Поскольку у мышей, подвергшихся частичной перевязке желчных протоков, со временем развился дольчато-специфический обструктивный холестаз, перевязанная доля выглядит немного бледнее по цвету через 14 дней после операции по сравнению с нелигированными долями, которые сохранили свой нормальный темно-красновато-коричневый цвет. Перевязанная доля также демонстрирует увеличение пролиферации желчных протоков и фиброза по сравнению с нелигированными долями в ответ на локализованный холестаз, вызванный лигированием.
После освоения этой техники ее можно выполнить за 10-12 минут, если она выполнена правильно. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как отслеживание родословной, чтобы ответить на дополнительные вопросы о хоуминге стволовых клеток в места повреждения и регенерации печени. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить значимые сравнения с использованием частичной перевязки желчных протоков для выявления местных и системных эффектов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена частичная перевязка желчного протока как хирургическая модель для изучения повреждения и регенерации печени у грызунов. Данный метод позволяет наблюдать за локализованным обструктивным холестазом и его влиянием на механизмы функционирования печени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Гепатология
- Регенерация печени
- Хирургические модели
Теоретические основы
- Понимание процессов повреждения и регенерации печени имеет решающее значение в гепатологии.
- Локализованный обструктивный холестаз позволяет получить ценные сведения о механизмах работы печени.
- Сравнительные исследования на одном и том же животном повышают достоверность результатов.
- Данная модель особенно полезна для изучения динамики восстановления печени.
Цель исследования
- Изучить влияние частичного перевязывания желчного протока на повреждение печени.
- Выявить механизмы, участвующие в регенерации печени.
- Создать надежную хирургическую модель для будущих гепатологических исследований.
Используемые методы
- Использование анестезированных мышей линии C57 black 6 для выполнения процедуры.
- Выбривание шерсти и дезинфекция брюшной области перед началом операции.
- Фиксация конечностей к операционному столу для обеспечения стабильности.
- Проведение операции под хирургическим микроскопом для обеспечения точности.
Основные результаты
- Продемонстрирована осуществимость хирургической модели.
- Разработан метод сравнения перевязанных и неперевязанных долей печени.
- Получены новые данные о регенеративных процессах в печени.
- Создана основа для дальнейшего изучения механизмов повреждения печени.
Выводы
- Частичное лигирование желчного протока является ценной моделью для изучения повреждения печени.
- Данная методика позволяет проводить контролируемые сравнения в рамках одного организма.
- В будущих исследованиях эта модель может быть использована для дальнейшего изучения регенерации печени.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Частичное перевязывание желчного протока (pBDL) представляет собой контролируемую модель для изучения локализованного обструктивного холестаза, позволяющую проводить прямое сравнение перевязанных и неперевязанных долей печени у одного и того же животного. Такой дизайн с внутренним контролем снижает вариабельность, уменьшает количество используемых животных и способствует снижению рисков при изучении механизмов валидации мишеней в гепатологии. Данный подход повышает прогностическую достоверность за счет изоляции специфических ответов каждой доли на накопление желчи и пути фиброза.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся локального повреждения печени и путей регенерации.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков путем сравнения специфических для каждой доли ответов на холестаз при идентичном генетическом фоне и условиях окружающей среды.
- Прогностическая ценность: облегчает приоритизацию портфеля препаратов за счет разграничения системных и локальных эффектов лекарственных средств на пролиферацию желчных протоков и фиброз.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных систем, релевантных заболеванию, для последующей стандартизации анализа с использованием биохимических показателей, специфичных для каждой доли органа.
- Операционная ценность: Повышение воспроизводимости за счет внутреннего контроля, что снижает необходимость в отдельных контрольных группах (sham groups) и минимизирует межиндивидуальную вариабельность животных.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы в доклинических моделях при исследовании механизмов действия лекарственных средств и миграции клеток в условиях холестаза.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, релевантным для заболевания, за счет моделирования обструктивного холестаза у человека с пролиферацией желчных протоков и фиброзом, специфичными для определенной доли печени.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от фундаментальных исследований к доклинической валидации, позволяя проводить исследования по отслеживанию клеточных линий и хомингу стволовых клеток после лигирования.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем количественной оценки локальных и системных ответов биомаркеров на компоненты застойной желчи.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
pBDL вписывается в континуум открытий — от валидации мишени до доклинических исследований, особенно в рамках программ по гепатологии, изучающих механизмы повреждения печени и регенераторные ответы.
- Фундаментальная биология: поддерживает проверку гипотез, позволяя сравнивать лигированные и нелигированные доли печени для изоляции локальных эффектов холестаза.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу биологических систем с количественными показателями, такими как биохимические показатели сыворотки крови печени и гистологические изменения пролиферации желчных протоков.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных, включая уровни ферментов, окраску долей и показатели фиброза для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преклиническую преемственность, поддерживая такие послеоперационные анализы, как отслеживание клеточного происхождения (lineage tracing), для изучения привлечения стволовых клеток в места повреждения.
- Повторное использование в корпоративном секторе: служит многократно используемой хирургической платформой для изучения эффектов лекарственных препаратов и клеточных механизмов в локализованных моделях заболеваний печени.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности путем внутреннего сравнения долей печени между собой.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость за счет устранения межиндивидуальной вариабельности с помощью внутриживотных контролей.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования ресурсов за счет сокращения потерь животных и расходов по сравнению с моделями полного перевязывания желчного протока.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков за счет разграничения локализованной токсичности препарата и системных эффектов на печень.
Особенности реализации
- Требуются навыки микрохирургии и доступ к хирургическим микроскопам для точного лигирования левого печеночного желчного протока.
- Зависит от наличия инструментария, включая нейлоновые нити 10-0, зажимы-москиты и средства поддержания стерильности операционного поля.
- Необходима межгрупповая стандартизация процедур послеоперационного мониторинга и отбора проб сыворотки крови для биохимического анализа.
- Требуется учитывать особенности адаптации при применении модели на других линиях мышей или при исследовании других долей печени.
- Применимо только в исследованиях, где обструкция конкретной доли является достаточной для моделирования интересующего патологического состояния человека.
