Транс внутренняя ячейка массы впрыска эмбриональных стволовых клеток приводит к более высоким ставкам химеризма

Общая цель этой модифицированной процедуры заключается в увеличении производства химерных продуктов без дополнительных затрат или длительных периодов обучения. Этот метод может помочь лабораториям стать более эффективными в производстве химер, особенно в тех случаях, когда количество ES-клеток не является оптимальным. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она не требует дополнительного оборудования и специализированной подготовки.

Демонстрировать процедуру сегодня будет Томас Хаглер. Он биолог и аспирант, который работает в основной лаборатории. Чтобы собрать эмбрионы, промокните матку на лабораторной ткани, чтобы удалить лишнюю кровь, и поместите орган в новую 60-миллиметровую чашку под препарирующим микроскопом с низким увеличением.

Используя рассекающие щипцы, чтобы осторожно и аккуратно удерживать матку возле яйцевода, введите иглу 25 калибра, прикрепленную к шприцу объемом 10 миллилитров, содержащему 10 миллилитров среды для сбора бластной воды, в центр матки сразу за кончиками щипцов в максимально параллельной плоскости. Надавите на щипцы, чтобы закрепить иглу внутри матки, и аккуратно промывайте примерно один миллилитр среды через маточный рог. Когда все бластоцисты будут удалены, соберите ротовую пипетку и используйте ротовую пипетку для переноса отдельных эмбрионов в отдельные капли среды для сбора бластов во второй 60-миллиметровой чашке.

Затем промойте каждый эмбрион во второй капле абразивной среды и перенесите эмбрионы в четырехлуночную чашку до их введения. Для начала используйте микроинъектор для подачи вакуума на иглу для инъекции. Поместите чашку с ES-клетками под инъекционный микроскоп, к которой прикреплены игла для инъекций и пипетка-держатель эмбрионов.

Для успеха инъекции важно уделить время правильной настройке микроскопа. Это включает в себя надлежащее количество среды в игле и правильное выравнивание оси z. С помощью микроинъектора подайте вакуум на иглу для инъекции.

Сохраняя как можно меньше пространства между клетками, втягивайте гладко расположенные эмбриональные клетки малого и среднего размера без явных дефектов из чашки эмбрионов. Собрав не менее 15 клеток, расположите эмбрион возле отверстия держателя. Подайте вакуум, чтобы закрепить эмбрион на держателе, и переместите удерживающую пипетку вверх или вниз, чтобы отрегулировать ось z, пока эмбрион не коснется предметного стекла.

Сосредоточьтесь на зоне пеллюцида и отрегулируйте ось z инъекционной иглы до тех пор, пока эмбриональные клетки рядом с кончиком иглы не окажутся в фокусе. При необходимости с помощью инъекционной иглы осторожно перекатывайте бластоцисту до тех пор, пока внутренняя клеточная масса не окажется в подходящем положении для инъекции. С помощью сильного, но контролируемого нажатия введите инъекционную иглу через зону пеллюцида во внутреннюю клеточную массу и слегка надавите на микроинъектор инъекционной иглы, чтобы предотвратить разрушение бластоцеле.

После того, как игла проникнет в бластоцеле, надавите на микроинъектор, чтобы перенести все эмбриональные стволовые клетки в эмбрион, делая короткую паузу, когда скос иглы начинает выходить из эмбриона, чтобы позволить давлению в эмбрионе вернуться к норме, сохраняя при этом клетки. После того, как все бластоцисты будут введены, используйте нехирургическое устройство для переноса эмбрионов, чтобы доставить эмбрионы к мышам стадии 2,5 Swiss Webster в соответствии с инструкциями производителя и содержать мышей по отдельности после каждого переноса, родов и последующего отлучения. В этом репрезентативном эксперименте частота наступления беременности не изменялась между транс-инъекционными группами внутренней клеточной массы и контрольной группой, получавшей традиционно инъекции, и равное количество детенышей дожило до отлучения от груди в каждой группе.

Примечательно, что в то время как количество мышей при отъеме оставалось неизменным, значительно большее число детенышей из группы трансинъекций внутренней клеточной массы продемонстрировало химеризм цвета шерсти по сравнению с контрольной инъекционной группой. Лучшая часть этого метода заключается в том, что он требует всего лишь простого изменения ориентации эмбриона, чтобы способствовать большему размножению химер. Правильная настройка микроскопа имеет важное значение.

Если микроскоп и манипуляторы не настроены должным образом и не обслуживаются должным образом, процесс инъекции не будет работать. Если вы новичок в инъекциях эмбрионов, повторение — единственный способ научиться. Для новичков работа с эмбрионами, как правило, является самой сложной частью процедуры.

Способность эффективно перемещать эмбрионы из одной чашки в другую, не теряя ни одного, является самой важной частью эксперимента. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как простое изменение стандартной техники инъекции может помочь вам стать более эффективным в производстве химер.