4.14: Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET)

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — явление, используемое для исследования биохимических взаимодействий на близком расстоянии. В FRET донорная фотолюминесцентная молекула может безызлучательно передавать энергию акцепторной молекуле, если их соответствующие спектры излучения и поглощения перекрываются. Количество передаваемой энергии и, следовательно, общее излучение образца зависит от близости пары акцептор-донор фотолюминесцентных молекул. Анализ FRET сочетается с другими биохимическими методами для получения подробной информации о биомолекулярных структурах и взаимодействиях от этой «спектроскопической линейки».

В этом видео рассматриваются принципы и концепции анализа FRET. Процедура сосредоточена на подготовке образцов для FRET и способах представления и интерпретации данных. Наконец, приложения включают мониторинг конформационных и клеточных процессов путем мечения частей клетки или белка, мониторинг ферментативных реакций, которые изменяют белковые структуры, и использование FRET для мониторинга агрегации мономеров, экспрессируемых клетками.

F?rster Resonance Energy Transfer, или FRET, представляет собой безызлучательный перенос энергии между светоизлучающими молекулами и часто используется для исследования биохимических взаимодействий на близком расстоянии. FRET возникает только тогда, когда флуоресцентные молекулы находятся на расстоянии 10 нм друг от друга. Анализ FRET можно комбинировать с другими методами для получения подробной структурной информации. В этом видео будут представлены основные принципы FRET, кратко изложен протокол и представление данных, а также обсуждены некоторые биохимические приложения.

Фотолюминесцентная молекула, такая как флуорофор, возбуждается за счет поглощения электромагнитного излучения на длине волны в спектре поглощения. Когда он расслабляется, он излучает свет на длине волны в пределах своего спектра излучения. Для получения дополнительной информации о флуоресценции смотрите видео JoVE о флуоресцентной микроскопии. Разные флуорофоры поглощают и излучают свет на разных длинах волн, которые часто перекрываются. Если спектр излучения флуорофора значительно перекрывается со спектром поглощения другого флуорофора, то «донор? высвободит виртуальный фотон, который будет поглощен «акцептором». Когда возбужденный донор находится в пределах 10 нм от акцептора, энергия передается от донора к акцептору посредством диполь-дипольных взаимодействий. Соответственно уменьшается выделение энергии за счет излучения света от донора. Между тем, возбужденный акцептор излучает свет на своей длине волны излучения. Отклик FRET оценивается с точки зрения эффективности, или процента энергии, высвобождаемой донором FRET, а не флуоресценцией или другими радиационными процессами. Эффективность сильно зависит от расстояния между донором и акцептором, что позволяет FRET действовать как «молекулярная» или «спектроскопическая» линейка.

В биохимии FRET часто используется для качественного наблюдения за конформационными изменениями молекул путем мониторинга флуорофоров, когда они входят и выходят из диапазона FRET друг от друга. Аналогичным образом, клеточные функции могут быть изучены с помощью молекул, содержащих пару FRET. Если меченая молекула расщепляется под действием фермента, FRET прекращается и наблюдаемая длина волны флуоресценции изменяется.

Теперь, когда вы понимаете принципы, лежащие в основе FRET, давайте рассмотрим обзор протокола и несколько способов представления и интерпретации данных.

Перед началом эксперимента представляющие интерес биомолекулы, как правило, ДНК или белки, были сконструированы с помощью флуоресцентных меток с использованием методов молекулярной биологии. Распространенными способами введения модифицированного генетического материала в клетки являются трансфекция и электропорация.

Затем клетки подготавливаются к визуализации FRET на флуоресцентном микроскопе. Например, молекулы могут быть иммобилизованы на предметном стекле для одномолекулярного FRET или образцы загружены в лунки для высокопроизводительного скрининга.

Затем подготавливаются лазеры возбуждения, микроскоп и сопутствующее оборудование. (A) В экспериментах с FRET часто используются мощные лазеры; (B) таким образом, следует использовать соответствующие СИЗ и процедуры безопасности. Затем образец помещают в прибор и подсвечивают возбуждающим лазером.

Для экспериментов по наблюдению за поведением клеток используются цветные изображения, показывающие различия или изменения в интенсивности излучения. Интенсивность излучения донора и акцептора строится на графике для отслеживания отклика FRET с течением времени.

Данные FRET также могут быть адаптированы к различным функциям для более сложного анализа. В зависимости от эксперимента, данные могут быть представлены несколькими способами для наилучшего представления результатов, что делает FRET гибким экспериментальным инструментом.

Теперь, когда вы знакомы с основами проведения и анализа эксперимента FRET, давайте рассмотрим некоторые применения FRET в биохимических исследованиях.

FRET может быть использован для изучения конформационных изменений или клеточных процессов путем маркировки частей белка или клетки, которые, по прогнозам, будут перемещаться в пределах 10 нм друг от друга, с помощью пары FRET. Например, белковые сенсоры получают путем мечения рецепторов парой флуорофоров. Реакция FRET контролируется в режиме реального времени с помощью конфокальной микроскопии. Вариации длины волны и интенсивности излучения указывают на конформационные изменения.

FRET также можно использовать для получения молекул с активной парой FRET и наблюдения за изменениями в ответе. При расщеплении субстрата FRET нарушается, вызывая увеличение донорской эмиссии и снижение акцепторной эмиссии. Выбросы анализируются для определения вклада донора, акцептора и FRET. После расчета коэффициентов прямого излучения для голубых и желтых флуоресцентных белков можно определить концентрацию и кинетические параметры субстрата.

Ячейки, предназначенные для экспрессии мономеров, содержащих любую из пар FRET, функционируют как «сенсоры» для взаимодействия между этими мономерами. Если агрегация этих мономеров индуцирована, то наблюдается ответ FRET. Это может быть использовано для исследования агрегации белков, вызванной «посевом» неправильно свернутых белков. Здесь клетки трансдуцировали агрегатами интересующего белка, инкубировали и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Вы только что посмотрели видео JoVE о резонансной передаче энергии F?rster, или FRET. Это видео содержало основные принципы FRET, подготовку и анализ эксперимента FRET, а также несколько биохимических приложений.

Спасибо за просмотр!