Интегрированная платформа для картирования генома общесистемной Chromatin государств с использованием высокопроизводительный чип последовательности в тканях опухоли

Общая цель данного протокола заключается в непредвзятой идентификации комбинаторных паттернов состояния хроматина в опухолевых тканях и линиях раковых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики рака, например, как состояние модификации бесплодных гистонов может способствовать генезу опухоли. Основное преимущество этой методики заключается в том, что несколько модификаций гистонов, а также несколько образцов могут быть обработаны как одновременно, так и эффективно.

Сначала вручную диссоциируйте 50 миллиграммов меланомного ткани и два миллилитра сбалансированного солевого раствора Хэнка или HBSS с помощью стерильного бритвенного лезвия. Измельчите ткань на кусочки по три-четыре миллиметра в течение примерно пяти минут в стерильной чашке для культивирования тканей. Переложите тканевый раствор в диссоциаторную трубку и добавьте еще восьмую миллилитров HBSS.

Далее диссоциируйте ткань, используя диссоциатор, до гомогенизации. Далее сшиваем ткань, добавляя 200 микролитров 16%-ного формальдегида на три миллилитра HBSS. С помощью миксера встряхивайте смесь со скоростью 10 об/мин ровно 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После извлечения образца из инкубатора добавьте 200 микролитров опухолевого глицина на три миллилитра образца и встряхивайте смесь при 10 об/мин в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Вращайте образец при 934 умноженных на g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия с помощью настольной центрифуги. Когда закончите, удалите надосадочную жидкость и добавьте пять миллилитров ледяного PBS.

Затем снова центрифугируйте образец при 934 g и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 300 микролитров буфера для сбора ChIP с ингибиторами протеазы на 50 миллиграммов ткани и лизируйте образцы на 30 минут на льду. Пока клетки лизуются, включите дезинтегратор водяной бани и связанную с ним систему охлаждения и дайте температуре достичь четырех градусов по Цельсию.

Поместите трубку ультразвукового аппарата в разрушитель водяной бани и обрабатывайте ткань меланомы ультразвуком в течение 60 циклов при 30 секундах включения и 30 секунд выключения для получения фрагментов хроматина от 200 до 600 пар оснований. Для получения восьми миллиграммов ткани меланомы инкубируйте три микрограмма каждого антитела к гистону с 20 микролитрами магнитных гранул белка и 100 микролитрами буфера для блокирования связывания в течение двух часов при четырех градусах Цельсия с вращением, используя трубчатый револьвер. После ультразвуковой обработки разбавьте образец в пять раз, используя буфер для разбавления ChIP, чтобы снизить концентрацию SDS до 0,1%После завершения инкубации магнитных шариков антитела и белка g удалите буфер для разбавления ChIP и снова суспендируйте гранулы в 240 микролитрах свежего буфера.

Затем поместите 20 микролитров аликвот бусин в 12 отдельных пробирок, каждая из которых будет использоваться для отдельного образца ткани. Равномерно распределите обработанный ультразвуком материал до гранул белка со специфическим антителом и вращайте трубки с помощью трубочного револьвера в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующее утро после обратного сшивания перенесите раствор белка антитела на 96-луночный планшет и поместите его на магнитную подставку.

Дав шарикам прилипнуть не менее 30 секунд, удалите надосадочную жидкость. Промойте шарики пять раз с помощью 150 микролитров ледяного буфера для промывки RIPA с помощью многоканальной пипетки. Непрерывно перемещайте магнит в течение 30 секунд за промывку, затем удалите надосадочную жидкость.

После этапов промывки добавьте мастер-смесь буфера для элюирования, содержащую 44 микролитра буфера прямого элюирования, один микролитр Rnase и пять микролитров протеназы k на чип, и введите образец для обратного сшивания. Инкубируйте образцы с помощью термоциклера ПЦР в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия, четырех часов при 50 градусах Цельсия и от восьми до 16 часов при 65 градусах Цельсия. На следующее утро поместите образцы обратно на магнит и перенесите надосадочную жидкость на новую 96-луночную ПЦР-планшет, которая содержит осажденную аминокислотами ДНК.

Добавьте в раствор 2,3 раза парамагнитные шарики и осторожно пипетируйте вверх и вниз 25 раз с помощью многоканальной пипетки. После этого выдерживают при комнатной температуре в течение четырех минут. Затем поместите образцы обратно на магнит и инкубируйте при комнатной температуре еще четыре минуты.

Выбросив надосадочную жидкость, добавьте в образцы 150 микролитров 70%-ного этанола и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 секунд, не нарушая гранулы. Дав бусинам высохнуть, снимите образцы с магнита и добавьте 30 микролитров 10 миллимоляров тразераля. Перемешайте пипеткой 25 раз.

После инкубации образцов при комнатной температуре поместите их обратно на магнит и инкубируйте при комнатной температуре еще четыре минуты. Перенесите 20 микролитров каждого образца в новую 96-луночную пластину для подготовки библиотеки. После амплификации ПЦР извлеките образцы и доведите общий объем до 100 микролитров, используя воду без ядер.

Выполните двусторонний парамагнитный выбор размера, сначала добавив 55 микролитров гранул в каждый образец и перемешав 25 раз с помощью пипетки. Затем выдерживают при комнатной температуре в течение четырех минут. Поместите образцы обратно на магнит и инкубируйте при комнатной температуре еще четыре минуты, чтобы получить крупные фрагменты на бусинах, которые не подходят для секвенирования.

После инкубации перенесите надосадочную жидкость в новую 96-луночную ПЦР-планшет. Добавьте еще 25 микролитров парамагнитных шариков и перемешайте пипетированием 25 раз и выдерживайте при комнатной температуре без магнита в течение четырех минут. После инкубации при комнатной температуре поместите образцы обратно на магнит и инкубируйте при комнатной температуре в течение четырех минут.

Затем выбросьте надосадочную жидкость. Оставив образцы на магните, добавьте 150 микролитров 70%-ного этанола и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 секунд, не тревожа шарики. Удалите этанол и повторите промывку.

Дав бусинам высохнуть, снимите образцы с магнита и добавьте 25 микролитров 10 миллимоляров с трацеральным pH 8,0. Перемешайте с помощью пипетки 25 раз и выдерживайте при комнатной температуре, отключив магнит в течение четырех минут. После инкубации при комнатной температуре поместите образцы обратно на магнит и инкубируйте при комнатной температуре в течение четырех минут.

Теперь количественно оцените библиотеки с помощью высокочувствительного инструмента для электроферограммы ДНК перед мультиплексированием, чтобы убедиться, что размеры подходят для секвенирования. Этот протокол позволяет проводить иммунопреципитацию замороженных опухолевых тканей и клеточных линий, которая может быть выполнена на десятках образцов и параллельно с использованием метода с высокой пропускной способностью. Фрагменты хроматина должны находиться в диапазоне от 200 до 1000 пар оснований для оптимальной иммунопреципитации.

Очищенная ДНК ChIP должна быть количественно определена, прежде чем приступать к подготовке библиотеки. Готовые библиотеки, пригодные для мультиплексирования и секвенирования следующего поколения, должны иметь от 200 до 600 пар оснований и быть лишены каких-либо димеров праймеров. После секвенирования существует множество метрик контроля качества, которые должны быть соблюдены, прежде чем переходить к дальнейшим шагам конвейера, таким как пиковые вызовы macs и анализ chromHmm.

Образцы ChIP должны быть обогащены входной ДНК, и каждая модификация гистонов должна отображать отчетливый профиль, представляющий определенный компонент эпигенетического ландшафта. Хромовый алгоритм HMM использует многомерную скрытую марковскую модель для идентификации наиболее заметных повторяющихся комбинаторных и пространственных паттернов хроматина на основе изученных модификаций гистонов. Используя эти шесть модификаций, chrome HMM идентифицирует функционально различные состояния хроматина, представляющие как репрессивные, так и активные домены, такие как поликомбная репрессия, гетерохроматическая репрессия, активная транскрипция и активные энхансеры.

После освоения этой техники ее можно сделать за три-четыре дня, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно определить оптимальные условия ультразвуковой обработки и спецификацию антител, прежде чем приступать к подготовке библиотеки и анализу данных. Для изучения этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование RRS и захват подтверждения хромосом, чтобы определить коалицию частей состояния хроматина с экспрессией гена и более высокой структурой хроматина.

После эксперимента этот метод проложил путь исследователям в области эпигенетики рака к изучению паттернов состояния хроматина в образцах опухолей пациентов. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как обрабатывать и диссоциировать опухолевые ткани, выполнять иммунопреципитацию хроматина, готовить библиотеки для секвенирования следующего поколения, обрабатывать данные после секвенирования и получить представление о начальных этапах последующего анализа. Не забывайте, что при работе с формальдегидом он может быть крайне опасным и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как соответствующий вытяжной шкаф.