Инжиниринг «Золотой» флуоресценции путем селективного давления включения неканонических аминокислот и белков анализ по масс-спектрометрии и флуоресценции

Цель этого эксперимента состоит в том, чтобы заменить каноническую аминокислоту неканонической аминокислотой для получения рекомбинантного белка путем селективного включения под давлением для получения нового флуоресцентного белка золота. Метод селективного встраивания под давлением предназначен для получения белков с новыми химическими свойствами. Это особенно полезно при попытке понять или спроектировать функцию белка.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он относительно прост в проведении, поскольку похож на обычное производство рекомбинантного белка. Коррелированная по времени и длине волны флуоресценция полезна для исследования динамики возбужденного состояния модифицированного белка, что, в свою очередь, облегчает понимание влияния неканонической аминокислоты, введенной в хромофор, на оптические свойства. В принципе, SPI может быть применен к любой среде производства белка, для которой доступны ауксотрофные штаммы и химически определенные среды.

К ним относятся другие штаммы бактерий, а также культура клеток млекопитающих. Время и настройка условий экспрессии имеют решающее значение, поскольку необходимо подавить производство немодифицированного белка дикого типа. Вот почему определенные параметры, такие как температура, время индукции или состав питательной среды, должны быть оптимизированы.

Идея этого метода впервые возникла после первоначальных исследований белкового экстракта с метилсодержащими аминокислотами, такими как селенометионин. Демонстрировать процедуру будет Альмут Пельцер, студент из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, трансформируйте триптофан-ауксотрофные клетки E.coli с экспрессией плазмиды для ECFP.

Используйте одну колонию для инокуляции предкультурной среды из пяти миллилитров LB с добавлением ампициллина в культуральную пробирку. Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту. На следующий день инокулируйте 100 миллилитров дополненной среды NMM19, используя один миллилитр ночной культуры в однолитровую колбу Эрленмейера.

Затем инкубируйте культуру в течение ночи в орбитальном вибростенде при 200 об/мин и 30 градусах Цельсия. На следующий день измеряйте оптическую плотность на уровне 600 нанометров каждые 30 минут, пока значение не изменится менее чем на 0,05 в течение 30 минут. Затем центрифугируйте культуру при 5000 g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы собрать бактериальные клетки.

Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации. Ресуспендируют клетки в среде NMM19 с добавлением ампициллина до общего объема 100 миллилитров. Перенесите эту суспензию обратно в ту же колбу Эрленмейера.

Добавьте 4-амино-индол до конечной концентрации одного миллимолара. Инкубируйте в орбитальном вибростенде в течение 30 минут при температуре 30 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту. Через 30 минут добавьте IPTG в культуру до конечной концентрации 0,5 миллимоляра, чтобы индуцировать экспрессию генов-мишеней.

Инкубируйте в течение ночи в орбитальном вибростенде при температуре 30 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту. На следующий день соберите бактериальные клетки, центрифугируя при температуре 5000 раз больше g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации.

Заморозьте клеточную гранулу при температуре минус 20 градусов Цельсия или минус 80 градусов Цельсия до готовности к выполнению целевой очистки белка. Во-первых, приготовьте лизат бактериальных клеток, как указано в текстовом протоколе. После подготовки хроматографической колонки в соответствии с инструкциями производителя используйте связующий буфер для уравновешивания иммобилизованной хроматографической колонки с ионами металлов.

Загрузите лизат на колонку до полного завершения. Обратите внимание на белок золотого цвета, связанный с хроматографической смолой. Промойте колонку связующим буфером.

Затем элюируйте целевой белок с помощью элюирующего буфера. Соберите и объедините все элюированные фракции, содержащие золотой флуоресцентный белок, который можно определить по видимому золотистому цвету. После этого приготовьте диализную мембрану с отсечкой молекулярной массы от 5 000 до 10 000 в соответствии с инструкциями производителя.

Диализуйте образец объемом в один миллилитр на фоне не менее 100 миллилитров буфера в течение как минимум двух часов. Для начала используйте буфер MS, чтобы разбавить образец белка до 0,1 миллиграмма на миллилитр, так что конечный объем составит 80 микролитров. Пипеткой аккуратно перемешать.

Переложите раствор во флакон автосамплера MS со стеклянным вкладышем, и закройте его крышкой. Переверните флакон, чтобы удалить пузырьки воздуха. Затем приготовьте заготовку, содержащую буфер MS во втором флаконе.

Поместите оба флакона в автоподатчик ВЭЖХ. После этого подготавливают и калибруют прибор МС в соответствии с инструкциями производителя. Установите объем впрыска автосамплера равным пяти микролитрам для высокопроизводительной жидкостной хроматографии в сочетании с методом времяпролетной масс-спектрометрии ионизации электрораспылением.

Создайте список работ для пустого прогона, за которым следует пример прогона GdFP. Назначьте объем инъекции, соответствующие положения флаконов автосамплера и запустите список работ. Для начала приготовьте раствор флуоресцентного белка золота и детектор для подсчета одиночных фотонов, коррелированных по времени и длине волны, как описано в текстовом протоколе.

Используя программное обеспечение для подсчета одиночных фотонов, регистрировать флуоресцентное излучение со скоростью подсчета около 200 000 фотонов в секунду до тех пор, пока примерно 10 000 отсчетов не будут накоплены в максимуме регистрации кривых затухания флуоресценции. После этого замените кювету для образца на кварцевую кювету длиной в один сантиметр, заполненную коллоидным диоксидом кремния в буфере PBS. Извлеките лазерный фильтр и отрегулируйте решетку для регистрации 470-нанометровых фотонов в центральном канале детектора.

Затем приобретайте функцию инструментального отклика до тех пор, пока в максимуме излучения не накопится примерно 10 000 отсчетов. Преобразуйте, подгоните и отобразите полученные данные, как указано в текстовом протоколе, чтобы получить спектры, связанные с распадом, которые представляют собой зависимость времени затухания флуоресценции от длины волны излучения. В этом исследовании масс-спектрометрия используется для подтверждения того, что вариант флуорофора типа флуорофора зеленого флуоресцентного белка со спектральным красным смещением, называемый золотым флуоресцентным белком, успешно производится.

В то время как ECFP дикого типа имеет расчетную массу белка 28 283,9 дальтон после созревания хромофора, соответствующая масса флуоресцентного белка золота составляет 28 313,9 дальтон. Деконволютированный спектр ESI-MS флуоресцентного белка золота демонстрирует пик основной массы на уровне примерно 28 314,1 дальтон, отклоняясь от теоретического значения менее чем на 10 частей на миллион. Это подтверждает включение неканонической аминокислоты путем селективного включения под давлением.

Спектр поглощения ECFP имеет два характеристических максимума на 434 нм и 452 нм. В отличие от него, флуоресцентный белок золота характеризуется одной широкой полосой поглощения с красным смещением с максимумом в 466 нанометров. В то время как максимум поглощения EGFP далее смещен в красное смещение до 488 нанометров, спектр флуоресцентного излучения флуоресцентного белка золота и соответствующий сдвиг Стокса GdFP означают, что он является наиболее красным смещением из всех производных зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria.

Здесь показано флуоресцентное излучение с временным разрешением, контролируемое подсчетом одиночных фотонов. Кривые распада демонстрируют несколько более быстрый затухание флуоресценции на глубине 600 нанометров, чем на глубине 550 нанометров. Флуоресцентное излучение золотого флуоресцентного белка сильно зависит от pH, как это характерно для многих вариантов зеленого флуоресцентного белка.

Как видно на рисунке, наблюдается явное снижение флуоресценции при более низком pH, хотя спектральные характеристики остаются постоянными. После освоения этой техники ее можно сделать за три дня, начав с колоний из трансформированных бактериальных клеток или из замороженных запасов глицерина. При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что целевая аминокислота истощена.

ncAA должен быть поглощен клеткой, биосовместим и включен в белки выбранным ауксотрофным штаммом. Следуя этой процедуре, можно получить большое разнообразие белков для инженерных целей. В зависимости от целевого белка, такие методы, как анализаторы стабильности белка, анализы ферментативной активности, флуоресцентная спектроскопия или кристаллизация белка, могут быть использованы для описания влияния неканонической аминокислоты на функциональные и структурные свойства.

После своего развития этот метод оказался очень полезным в области синтетической биологии, обеспечив его новыми для природы белками и протеомами. Это расширяет химические возможности для белковой инженерии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как встраивать неканонические аминокислоты в рекомбинантные белки путем селективного включения под давлением, как проверить введение искусственной аминокислоты с помощью масс-спектрометрии и как анализировать флуоресцентный белок с помощью флуоресценции с временным разрешением.