Производства и очистки бакуловирусы для применения генной терапии

Общая цель этого протокола заключается в получении бакуловируса в культуре клеток насекомых, очистке с помощью гепариновой аффинной хроматографии и концентрировании с помощью ультрацентрифугирования. Конечный продукт может быть использован для переноса генов in vivo или в качестве вакцины. Этот метод может помочь исследователям, которые хотят использовать очищенный и концентрированный бакуловирус для применения в генной терапии.

Частицы бакуловируса могут содержать клеточный мусор и белки из культуры Sf9, которые могут вызывать воспаление или иммунный ответ при использовании у людей. Чтобы избежать токсичности, бакуловирус очищают и отделяют от загрязняющих частиц. Некоторые части процедуры будут продемонстрированы Марилу Нарцисо, научным сотрудником из моей лаборатории.

Для создания суспензионной культуры необходимо засеять 50 миллилитров клеток Sf9 в среду для культивирования насекомых в поликарбонатную колбу Эрленмейера объемом 250 миллилитров. И поместите колбу в орбитальный вибростенд. Добавьте два миллилитра бакуловируса P2 в клетки и встряхивайте со скоростью 135 об/мин, поддерживая постоянную температуру 28 градусов по Цельсию.

Через четыре дня после заражения вся популяция клеток Sf9 проявляет цитопатический эффект, что является признаком продукции бакуловируса с высоким титром. Последовательно амплигируйте бакуловирус до получения желаемого объема, увеличивая объем клеточной культуры при каждой последующей инфекции от 10 до 50 раз. После центрифугирования конечного надосадочной жидкости бакуловируса в течение 30 минут при 1000г и четырех градусах Цельсия отделить ход клеточного мусора, перенести надосадочную жидкость в чистый сосуд и обработать нуклеазой в дозе 50 единиц на миллилитр в течение двух часов при 37 градусах Цельсия для переваривания геномной ДНК и РНК.

Наконец, отфильтруйте вирусную надосадочную жидкость через фильтрационную установку 0,45 микрона. Настройте хроматографическую систему, поместив промывочную буферную линию от входного порта A1 в бутылку, содержащую не менее 500 миллилитров промывочного буфера. Используйте входной порт буфера A2 для загрузки буфера элюирования.

Вставьте несколько 50 миллилитровых конических трубок в коллектор фракций, чтобы собрать промежуточную жидкость для промывки в колонке, буфер для промывки и ускользающий бакуловирус. Уравновесьте гепариновую колонку пятью объемами промывочного буфера по 7,9 миллилитров при линейной скорости потока семь миллилитров в минуту. Загрузите 250 миллилитров надосадочной жидкости бакуловируса в гепариновую колонку с помощью насоса для отбора проб входного отверстия для отбора проб с линейной скоростью потока два миллилитра в минуту.

Затем пропустите 10 объемов промывочного буфера через гепариновую колонку с линейной скоростью потока два миллилитра в минуту до тех пор, пока кривая поглощения ультрафиолета не вернется к исходному уровню и не станет стабильной. Ускользающие частицы бакуловируса из гепариновой колонки с помощью пяти колонок объемом элюирующего буфера с линейной скоростью потока четыре миллилитра в минуту. Следите за резким пиком элюирования белка на хроматограмме, когда частицы бакуловируса диссоциируют от гепаринового столбика.

После элюирования немедленно разбавьте ускользнувшую надосадочную жидкость бакуловируса в 10 раз, используя 20-миллиметровый буфер фосфата натрия, чтобы предотвратить активацию частиц бакуловируса от осмотического шока во время последующего центрифугирования. Начните процедуру концентрирования с добавления равного объема надосадочной жидкости бакуловируса в автоклав в ультрацентрифужные пробирки. Измерьте вес пробирки с помощью весов и отрегулируйте массу содержимого ультрацентрифужных пробирок с помощью стерильного PBS.

Поместите каждую из ультрацентрифужных пробирок в противоположное ведро ротора SW 32 Ti и запустите ультрацентрифугу при температуре 80 000 г в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования откройте ультрацентрифужные пробирки в шкафу для культуры тканей и асептически отсасывайте жидкость, не удаляя гранулу бакуловируса. Добавьте 200 микролитров PBS, содержащего 0,5% BSA, и повторно суспендируйте каждую гранулу, энергично пипетируя вверх и вниз.

Наконец, перенесите от 50 до 100 микролитров концентрированного бакуловируса в криовиалы и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Титры бакуловируса оценивали по инфицированию клеток HT1080. Линия, соединенная ромбами, показывает общее количество инфекционных единиц бакуловируса в каждой фракции.

Частицы бакуловируса прочно связываются с гепариновой колонкой, поэтому в буфере для промывки колонки не обнаруживается значительное количество вируса. Резкий пик белка наблюдается при элюировании, что соответствует бакуловирусной фракции. Параметры, используемые в этом протоколе, максимизируют выход и минимизируют инактивацию инфекционных частиц бакуловируса.

Этот протокол может быть использован для очистки других вирусов и белков, которые имеют сродство к гепарину.