Производства и очистки бакуловирусы для применения генной терапии
April 9th, 2018
В этом протоколе бакуловирусы производится переходных трансфекции бакуловирусы плазмида в Sf9 клетки и усиливается в культуре подвеска сыворотки бесплатно. Супернатант очищается хромотографией сродства гепарин и далее сосредоточена на ultracentrifugation. Этот протокол используется для производства и очистки бакуловирусы для генной терапии приложения.
Общая цель этого протокола заключается в получении бакуловируса в культуре клеток насекомых, очистке с помощью гепариновой аффинной хроматографии и концентрировании с помощью ультрацентрифугирования. Конечный продукт может быть использован для переноса генов in vivo или в качестве вакцины. Этот метод может помочь исследователям, которые хотят использовать очищенный и концентрированный бакуловирус для применения в генной терапии.
Частицы бакуловируса могут содержать клеточный мусор и белки из культуры Sf9, которые могут вызывать воспаление или иммунный ответ при использовании у людей. Чтобы избежать токсичности, бакуловирус очищают и отделяют от загрязняющих частиц. Некоторые части процедуры будут продемонстрированы Марилу Нарцисо, научным сотрудником из моей лаборатории.
Для создания суспензионной культуры необходимо засеять 50 миллилитров клеток Sf9 в среду для культивирования насекомых в поликарбонатную колбу Эрленмейера объемом 250 миллилитров. И поместите колбу в орбитальный вибростенд. Добавьте два миллилитра бакуловируса P2 в клетки и встряхивайте со скоростью 135 об/мин, поддерживая постоянную температуру 28 градусов по Цельсию.
Через четыре дня после заражения вся популяция клеток Sf9 проявляет цитопатический эффект, что является признаком продукции бакуловируса с высоким титром. Последовательно амплигируйте бакуловирус до получения желаемого объема, увеличивая объем клеточной культуры при каждой последующей инфекции от 10 до 50 раз. После центрифугирования конечного надосадочной жидкости бакуловируса в течение 30 минут при 1000г и четырех градусах Цельсия отделить ход клеточного мусора, перенести надосадочную жидкость в чистый сосуд и обработать нуклеазой в дозе 50 единиц на миллилитр в течение двух часов при 37 градусах Цельсия для переваривания геномной ДНК и РНК.
Наконец, отфильтруйте вирусную надосадочную жидкость через фильтрационную установку 0,45 микрона. Настройте хроматографическую систему, поместив промывочную буферную линию от входного порта A1 в бутылку, содержащую не менее 500 миллилитров промывочного буфера. Используйте входной порт буфера A2 для загрузки буфера элюирования.
Вставьте несколько 50 миллилитровых конических трубок в коллектор фракций, чтобы собрать промежуточную жидкость для промывки в колонке, буфер для промывки и ускользающий бакуловирус. Уравновесьте гепариновую колонку пятью объемами промывочного буфера по 7,9 миллилитров при линейной скорости потока семь миллилитров в минуту. Загрузите 250 миллилитров надосадочной жидкости бакуловируса в гепариновую колонку с помощью насоса для отбора проб входного отверстия для отбора проб с линейной скоростью потока два миллилитра в минуту.
Затем пропустите 10 объемов промывочного буфера через гепариновую колонку с линейной скоростью потока два миллилитра в минуту до тех пор, пока кривая поглощения ультрафиолета не вернется к исходному уровню и не станет стабильной. Ускользающие частицы бакуловируса из гепариновой колонки с помощью пяти колонок объемом элюирующего буфера с линейной скоростью потока четыре миллилитра в минуту. Следите за резким пиком элюирования белка на хроматограмме, когда частицы бакуловируса диссоциируют от гепаринового столбика.
После элюирования немедленно разбавьте ускользнувшую надосадочную жидкость бакуловируса в 10 раз, используя 20-миллиметровый буфер фосфата натрия, чтобы предотвратить активацию частиц бакуловируса от осмотического шока во время последующего центрифугирования. Начните процедуру концентрирования с добавления равного объема надосадочной жидкости бакуловируса в автоклав в ультрацентрифужные пробирки. Измерьте вес пробирки с помощью весов и отрегулируйте массу содержимого ультрацентрифужных пробирок с помощью стерильного PBS.
Поместите каждую из ультрацентрифужных пробирок в противоположное ведро ротора SW 32 Ti и запустите ультрацентрифугу при температуре 80 000 г в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования откройте ультрацентрифужные пробирки в шкафу для культуры тканей и асептически отсасывайте жидкость, не удаляя гранулу бакуловируса. Добавьте 200 микролитров PBS, содержащего 0,5% BSA, и повторно суспендируйте каждую гранулу, энергично пипетируя вверх и вниз.
Наконец, перенесите от 50 до 100 микролитров концентрированного бакуловируса в криовиалы и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Титры бакуловируса оценивали по инфицированию клеток HT1080. Линия, соединенная ромбами, показывает общее количество инфекционных единиц бакуловируса в каждой фракции.
Частицы бакуловируса прочно связываются с гепариновой колонкой, поэтому в буфере для промывки колонки не обнаруживается значительное количество вируса. Резкий пик белка наблюдается при элюировании, что соответствует бакуловирусной фракции. Параметры, используемые в этом протоколе, максимизируют выход и минимизируют инактивацию инфекционных частиц бакуловируса.
Этот протокол может быть использован для очистки других вирусов и белков, которые имеют сродство к гепарину.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол описывает производство и очистку бакуловируса с использованием культуры клеток насекомых. Бакуловирус очищается с помощью гепариновой аффинной хроматографии и концентрируется путем ультрацентрифугирования, что делает его пригодным для применения в генной терапии.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Генная терапия
- Производство вирусных векторов
- Культура клеток насекомых
Фон
- Бакловирус может использоваться для in vivo переноса генов или в качестве вакцины.
- Загрязняющие клеточные осколки могут вызвать воспаление или иммунные реакции.
- Очистка необходима, чтобы избежать токсичности в терапевтических применениях.
- Этот метод полезен для исследователей, нуждающихся в концентрированном бакуловирусе.
Цель исследования
- Производство бакуловируса в бессуточной суспензионной культуре.
- Очистка бакуловируса для удаления загрязнений.
- Предоставление надежного метода для применения в генной терапии.
Используемые методы
- Транзиентная трансфекция плазмиды бакуловируса в клетки Sf9.
- Амплификация бакуловируса в бессуточной культуре.
- Очистка с помощью гепариновой аффинной хроматографии.
- Концентрирование путем ультрацентрифугирования.
Основные результаты
- Успешно произведен и очищен бакуловирус.
- Устранены клеточные осколки и белки из конечного продукта.
- Доказана возможность использования бакуловируса для генной терапии.
- Предоставлен четкий протокол для исследователей в этой области.
Выводы
- Протокол эффективен для производства и очистки бакуловируса.
- Он устраняет потенциальные проблемы токсичности, связанные с загрязнениями.
- Этот метод может повысить безопасность и эффективность применения генной терапии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Baculovirus is emerging as a promising gene therapy vector due to its capacity for high-titer production and purification. This protocol enables scalable manufacturing of clinical-grade baculovirus by eliminating cytotoxic contaminants through heparin affinity chromatography and ultracentrifugation. The method supports translational advancement by delivering purified, concentrated viral particles suitable for in vivo gene transfer applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of baculovirus-mediated gene delivery in preclinical models.
- Operational Value: Provides a reproducible system for assessing transgene expression and vector potency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized baculovirus batches for consistent transduction efficiency assays.
- Operational Value: Ensures contaminant-free preparations that reduce variability in downstream functional readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports dose-response studies by delivering quantifiable infectious units.
- Operational Value: Facilitates GLP-compatible purification workflows for toxicology and biodistribution studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early-stage vector production with preclinical validation by generating purified baculovirus suitable for efficacy and safety testing.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of baculovirus as a gene therapy vector through controlled transgene delivery.
- Screening: Delivers standardized viral preparations for reproducible assay performance across compound or promoter evaluations.
- Analytics: Yields quantifiable infectious titers via HT1080 cell infection assays, enabling comparative vector potency measurements.
- Translational Research: Provides a scalable bridge from laboratory-scale production to preclinical studies requiring defined vector doses.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular purification platform adaptable to other heparin-binding viral vectors or proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by removing Sf9-derived contaminants that could confound immune or toxicity readouts.
- Operational Value: Achieves 500-fold concentration with 25% infectious particle recovery, enabling efficient manufacturing scaling.
- Strategic Value: Mitigates late-stage biological risk by ensuring vector purity, a critical factor in gene therapy IND-enabling studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing a reliable, scalable source of clinical-grade baculovirus.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect cell culture and virology techniques.
- Depends on access to heparin affinity chromatography systems and ultracentrifugation equipment.
- Necessitates standardized buffer preparation and sterile handling to maintain vector integrity.
- Involves optimization of infection multiplicity and harvest timing for consistent yields across scales.
- Limited by the inherent production capacity of Sf9 suspension cultures, requiring scale-out for clinical doses.
