Визуализация актина и микротрубочек Cytoskeletons на B-клетки иммунной синапса, с помощью микроскопии простимулированное излучение истощения (интереса)

Общая цель этого протокола заключается в окрашивании актина и цитоскелетов микротрубочек в иммунном синапсе В-клеток для стимуляции истощения излучения, или микроскопии ЗППП, а также визуализации их структуры, организации в пространственных отношениях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы об организации цитоскелета во время активации В-клеток, включая реорганизацию актина и цитоскелета микротрубочек во время формирования иммунных синапсов. Основное преимущество многоцветной микроскопии STED заключается в том, что она позволяет одновременно визуализировать актиновый цитоскелет, сеть микротрубочек и ключевые белки, связанные с цитоскелетом, с нанометровым разрешением.

Хотя этот метод может дать представление об активации В-клеток, он также может быть применен для формирования иммунных синапсов других типов иммунных клеток, таких как естественные киллеры и Т-клетки. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, обнаружат, что оптимизация настроек микроскопа для одновременной визуализации и нескольких флуорофоров с использованием STED потребует некоторой практики. Демонстрировать эту процедуру вместе с Цзя и Мэдисон будут Кейт Чой и Кейтлин Притчард.

Начните с центрифугирования в 2,5 раза по 10 до 6-й клетки В-лимфомы А20 на каждую трансфекцию и повторного суспендирования клеток в 100 микролитрах реагента для трансфекции с добавлением от 1 до 2,5 микрограммов ДНК плазмы, представляющей интерес. Аккуратно перемешайте растворы и переложите каждую аликвоту клеток в отдельные лунки шестилуночного планшета. Отрегулируйте объем в каждой лунке до двух миллилитров при температуре 37 градусов Цельсия полной среды и поместите клетки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 18 часов.

На следующее утро окуните 1,5 18-миллиметровые круглые стеклянные покровные стекла в 100% метанол и дайте покровным стеклам полностью высохнуть в течение примерно 10 минут. Поместите высушенные покровные стекла в отдельные лунки 12-луночного планшета для культуры тканей и добавьте 400 микролитров антитела козьего антимышиного иммуноглобулина G в центр каждого покровного стекла так, чтобы в центре образовался пузырь, который распространился по краям, не капая в лунку. Инкубируйте покровные стекла при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем промойте покровные стекла одним миллилитром стерильного PBS на лунку три раза, чтобы удалить все несвязанные антитела. После последней стирки храните каждый покровный лист в одном миллилитре свежего, стерильного PBS до посева клеток. Когда трансфицированные клетки будут готовы, соберите их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров методом центрифугирования и повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре модифицированного буферного раствора HEPES с добавлением FBS.

После подсчета разбавьте клетки до двух на 10 до 5-й концентрации клеток на миллилитр и модифицированного буферного раствора HEPES плюс FBS, и с помощью щипцов перенесите каждый покровный лист на кусок парафиновой пленки. Добавьте 250 микролитров клеток в каждую покровную крышку и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут в темноте, чтобы позволить клеткам распространиться по поверхностям, покрытым антииммуноглобулином G. В конце инкубации удалите излишки физиологического раствора с каждого предметного стекла и покройте каждый покровный лист 350 микролитрами фиксатора, следя за тем, чтобы вся поверхность была покрыта.

После 10 минут в темноте при комнатной температуре с помощью микропипетки осторожно отсасывайте фиксатор от края каждого покровного стекла и промойте покровные стекла 500 микролитрами проникающего и блокирующего буфера. Затем проникните и заблокируйте клетки 250 микролитрами свежей пермеабилизации и блокирующим буфером на 10 минут при комнатной температуре в темноте. Далее удалите излишки буфера и пометьте клетки 50 микролитрами первичного антитела, представляющего интерес, в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре.

В конце инкубации промойте покровное стекло три раза с 500 микролитрами буфера для окрашивания на одну стирку и добавьте 50 микролитров соответствующего вторичного антитела к каждому покровному листу в течение 30 минут при комнатной температуре. После промывки вторичного антитела добавьте 10 микролитров монтажного реагента на предметное стекло микроскопа и закрепите покровные стекла на отдельных предметных стеклах микроскопа клеточной стороной вниз. Затем дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи в темноте для визуализации на следующий день.

Чтобы визуализировать клетки с помощью микроскопии, ЗППП сначала включите микроскоп ЗППП. Активируйте лазеры в эпифлуоресцентной лампе освещения и откройте программное обеспечение микроскопа. Задайте параметры для лазеров истощения STED и загрузите первый образец в микроскоп.

С помощью окуляра вручную сфокусируйтесь на образце, чтобы выбрать ячейку с умеренным выражением GFP. Увеличьте масштаб выбранной ячейки и выберите область интереса для изображения. Отрегулируйте фокус таким образом, чтобы в фокусе находилась плоскость XY ячейки, которая находится ближе всего к покровному стеклу.

Затем на вкладке «Получение» программного обеспечения установите флажок «Между кадрами» на панели «Последовательное сканирование», чтобы установить для получения изображения значение «Последовательное получение кадра». Установите мощность лазера STED для каждого флуорофора и с помощью ползунка отрегулируйте мощность лазера в соответствии с флуорофорами, используемыми в эксперименте. Чтобы увеличить разрешение и уменьшить фоновый сигнал, откройте настройки съемки и в выпадающем меню выберите значение больше единицы для увеличения усреднения линии и/или кадра.

Проверьте параметр усиления для каждого флуорофора и конкретные значения усиления по времени, чтобы получить соответствующий флуоресцентный сигнал для стационарного STED и увеличить мощность лазера STED для повышения разрешения. Крайне важно оптимизировать выигрыш времени сбора данных для образца микроскопа и используемых флуорофоров для повышения разрешения без потери слишком большого количества флуоресцентного сигнала. Затем вручную получите несколько изображений, чтобы обеспечить воспроизводимость, и деконволютируйте изображения с помощью программного пакета для деконволюции в соответствии с инструкциями производителя.

Для клеток В-лимфомы А20 распространяются на иммобилизованные антитела к NT-иммуноглобулину. Микроскопия ЗППП, используемая в сочетании с программным обеспечением для деконволюции, обеспечивает изображения цитоскелетных структур с более высоким разрешением, чем только конфокальная микроскопия. Несмотря на то, что деконволюция конфокальных изображений приводит к значительному улучшению разрешения изображения, деконволюционные изображения STED предоставляют более подробную структурную информацию, чем деконволюционные конфокальные изображения.

Одноцветное STED также может быть использовано для получения трехмерных изображений со сверхвысоким разрешением всей цитоскелетной сети B-клеток. На этих многоцветных изображениях STED окрашивание периферического кольца дендритного актина может наблюдаться в сочетании с окрашиванием микротрубочек. При использовании клеток, трансфицированных флуоресцентными гибридными белками, достижение оптимальных уровней экспрессии и предотвращение артефактов из-за чрезмерной экспрессии являются важными факторами, в то время как слишком низкая экспрессия флуоресцентного гибридного белка также приводит к низкому качеству изображений.

Также важна тщательная фокусировка, чтобы охватить всю интересующую область. Например, на этом изображении только части сети микротрубочек находились в ближайшей к покровной плоскости фокальной плоскости, что не позволяло провести полный анализ образца. После освоения этой техники ее можно освоить за два дня.

Один день для подготовки образца и окрашивания и один день для визуализации ЗППП. Важно помнить о титровании количества плазмы, которое будет использоваться для трансфекции клеток, чтобы получить достаточную экспрессию флуоресцентного белка для обнаружения во время визуализации, избегая при этом артефактов от чрезмерной экспрессии. После этой процедуры можно индуцировать экспрессию различных флуоресцентных гибридных белков, чтобы облегчить локализацию других белков, регулирующих динамику и организацию цитоскелета, или визуализировать субклеточное распределение белков, участвующих в других клеточных процессах.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать микроскопию STED для визуализации структур цитоскелета и белков, которые участвуют в формировании иммунных синапсов. Не забывайте, что работа с фиксаторами, такими как глутаральдегид, может быть чрезвычайно опасной, и что при использовании таких реагентов всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу для химических веществ.