Трехмерные визуализации и анализа полученных, пояснил человеческого плацентарного ворсинчатых сосудистой сети

Общая цель этой процедуры заключается в создании трехмерных визуализаций фрагментов ворсинчатого дерева плаценты, пригодных для анализа содержащихся в них сосудистых сетей. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в нашей области, например, почему у ребенка может быть задержка в росте или какой стресс и насколько сильным мог быть стресс, который привел к преждевременным родам. Основное преимущество нашей процедуры заключается в том, что теперь мы можем иммуномаркировать прозрачную ткань ворсинчатого дерева плаценты, а затем визуализировать их сосудистые сети и использовать эти визуализации для характеристики и анализа этих сосудистых сетей.

Применение этого метода может распространяться на многие диагнозы и методы лечения, поскольку большинство медико-биологических наук полагаются на двумерную гистологическую характеристику. Демонстрировать процедуру будет г-жа Валери Швенк, которая будет проводить иммуномаркирование и очистку плацентарной ткани, а затем г-н Филипп Некайз будет проводить диссекцию плацентарной ткани и обратное очищение ткани. Чтобы подготовиться к вскрытию ворсинчатого дерева, сначала промойте формальную и неподвижную плацентарную ткань фосфатным солевым раствором.

Затем поместите в чашку Петри на столик для диссекционного микроскопа. Чтобы найти ворсинчатое дерево, используйте скальпель и тонкие щипцы, чтобы разорвать плацентарную ткань на части. Затем препарируйте кусочки ворсинчатого дерева длиной примерно пять миллиметров и перенесите в микротрубку, содержащую один миллилитр фосфатного буферного раствора.

Замените буферизованный фосфатами солевой раствор на свежий и подождите 10 минут, время от времени перемешивая. Затем замените фосфатно-солевой буфер на проникающий буфер для проникновения в ткань и блокирования неспецифического связывания вторичных антител. Затем выдерживайте в течение 30 минут.

Затем замените проникающий буфер фосфатным солевым раствором, содержащим двухпроцентную козью сыворотку с мышиным моноклональным анти-CD31 и кроличьим анти-CK7. Оставьте салфетку при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На следующий день удалите оставшиеся антитела с помощью дополнительных полосканий фосфатно-соевым буфером с двухпроцентной козьей сывороткой.

Затем удалите фосфатно-солевой буфер с двухпроцентной козьей сывороткой и добавьте такой же буфер, дополненный козьим антимышиным иммуноглобулином G в сочетании с зеленым флуорофором и козьим антикроличьим иммуноглобулином G в сочетании с инфракрасным флуорофором. Выдерживать 30 минут в темноте при комнатной температуре. Затем промойте салфетку один раз PBS-GS и храните маркированную салфетку в темноте при комнатной температуре, пока она не прозрачится.

Промойте образцы три раза PBS с интервалом в 10 минут. Чтобы обезвожить ткань, удалите фосфатно-солевой буфер, добавьте в ткань 50% этанола и инкубируйте в течение 10 минут. После инкубации выбросьте и затем промойте три раза с 70% этанолом с интервалом в 10 минут, а затем три промывки 100% этанолом с интервалом в 15 минут.

Затем с помощью щипцов с тонким наконечником перенесите ткань в микротрубку, заполненную одним миллилитром раствора, на четыре часа. Через четыре часа перенесите ткань в микротрубку, наполненную раствором два, и инкубируйте еще четыре часа. Чтобы установить ткань в камеру Сайкса-Мура, используйте щипцы с тонкими наконечниками, чтобы разместить 25-миллиметровую круглую крышку на основании камеры.

Опять же, с помощью щипцов с тонким наконечником поместите резиновую прокладку в основание на покровном листе. Снимите смоченную в растворе ткань и положите ее на центр крышки листом. Затем добавьте каплю второго раствора, примерно 40 микролитров, на ткань.

Затем возьмите второй защитный лист и поместите его поверх прокладки. Затем плотно сожмите крышку и прокладку, вставив стопорное кольцо в верхнюю часть основания. Затем вставьте иглу 25 калибра через прокладку в порт на основании.

Далее наполните трехмиллилитровый шприц одной целой пятью миллилитрами раствора двух. Затем установите иглу 25 калибра на шприц и вставьте иглу в противоположное отверстие через прокладку. Затем начните вводить в камеру второй раствор и убедитесь, что воздух внутри камеры выходит через другую иглу 25 калибра.

Когда камера заполнится, извлеките иглу и шприц и поместите держатель камеры Сайкса-Мура на предметный столик конфокального микроскопа. Используйте объектив с 10-кратным увеличением, чтобы сфокусировать ткань, размещенную на камере. Затем установите точку отсчета для предметного столика и перемещайте предметный столик микроскопа вверх и вниз по фокальной плоскости, чтобы определить и установить верхнюю и нижнюю части ткани.

Установите размер шага на две целых пять микрометров и соберите файл конфокального изображения, содержащий набор изображений ткани сверху вниз. Затем перенесите ткань в микротрубку, содержащую более чем в 20 раз больше 100% этанола, чтобы обратить вспять очищение. Затем, через каждый часовой интервал, заменяйте на 70, а затем на 50% этанол и, наконец, фосфатно-солевой буфер.

Хранить при температуре четыре градуса Цельсия в темноте до заделки. Здесь для демонстрации плацентарной сосудистой сети были получены как микроскопические, так и конфокальные микроскопические изображения плаценты человека. На этих микроскопических изображениях плаценты видны лучистые ворсинчатые деревья, проникшие в плацентарную паренхиму.

Эти микроскопические изображения показывают наличие дистальной части кусочков ворсинчатого дерева, заканчивающегося скоплением ворсинок. Затем, чтобы показать слой трофобласта ворсинок, дистальная часть ворсинчатого дерева была помечена иммунометкой. На изображении наружный слой трофобласта показан зеленым цветом, а капилляры — красным.

Затем для проверки плацентарной ткани до и после очищения были получены конфокальные изображения неочищенных и очищенных тканей плаценты. Изображения показывают, что для неочищенной ткани иммунофлуоресценция может быть зафиксирована на глубине 100 микрометров или меньше. Напротив, для очищенной плацентарной ткани иммунофлюоресценция может быть захвачена на гораздо большей глубине.

Кроме того, для сравнения обычной ткани с перевернутыми прозрачными срезами, очищенную ткань обезвоживали в обратном процессе с помощью этанола. Иммуногистохимическое окрашивание плацентарной ткани анти-CK7 до и после очищения не показало существенных изменений морфологии ткани в связи с очищением. На анимации видно, что иммуноокрашенная ворсинчатая ткань распределена по всей глубине объема ткани.

Как только вы освоите процедуру, вы можете ожидать, что она займет около 18 часов, разделенных на три дня. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что она требует нескольких различных наборов навыков. Нужно уметь делать плацентарную патологию, конфокальную микроскопию.

Вы должны уметь генерировать трехмерные рендеры изображений, и вы должны быть знакомы с обработкой и анализом иммунитета. После этой процедуры могут быть проведены другие методы, такие как традиционная гистология, STS page или maldi. С его развитием этот метод открывает путь в области медицины матери и плода, неонатологии и биологии трофобласта для изучения коренных причин, лежащих в основе преэклампсии, плохого роста плода и дистресса плода.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как очищать, визуализировать и анализировать плацентарные ворсинчатые ткани дерева. Большое спасибо за просмотр видео и удачи в ваших экспериментах.