Сушеные крови и сыворотке пятна как полезный инструмент для хранения проб для оценки рака Биомаркеры

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы трансляционных исследований, такие как возможность изучения биомаркеров у пациентов из развивающихся стран. Основным преимуществом этого метода является возможность хранить образцы крови и сыворотки не менее двух недель без замораживания и предоставлять высококачественный материал для последующего анализа, такого как количественная ПЦР и ИФА. Применение этого метода распространяется на диагностику таких заболеваний, как рак и инфекционные заболевания.

Этот метод также может быть применен в диагностических или исследовательских областях, таких как изучение пренатальных заболеваний или анализ инфекционной патологии, такой как ВИЧ. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы начали сравнивать биомаркеры между европеоидной и африканской серией случаев, для которых замороженные образцы были недоступны. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы определения кровянистых выделений трудно освоить.

При этой процедуре три миллилитра образца крови собираются в трехмиллилитровую пробирку с 5,4 миллиграммами ЭДТА. Напишите код пациента в правом нижнем углу сберегательной карты. Осторожно повторно суспендируйте кровь пятимиллилитровой пипеткой.

Затем сделайте пипетку и перенесите одно пятнышко крови на сберегательную карту. Используя новый наконечник для каждой аликвоты крови, повторите мажущие выделения, чтобы получить в общей сложности от трех до пяти кровяных пятен. Оставьте высохшие пятна крови (DBS) высыхать на ночь при комнатной температуре, открыв крышку сберегательной карты в горизонтальном положении на открытой, невпитывающей поверхности и избегая попадания прямых солнечных лучей.

На следующий день храните карту при комнатной температуре в полиэтиленовом пакете с влагопоглотителем до использования. ДНК будет извлечена из трех высушенных пятен крови с карты сэйвера. Начните с вырезания каждого из DBS с карты и отделения их от карты.

Отделенный DBS нарезать небольшими кусочками диаметром около одного миллиметра. Поместите мелкие кусочки из одного DBS в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Чтобы переварить образцы, добавьте в пробирку 180 микролитров буфера для лизиса из коммерчески доступного набора для экстракции ДНК, затем добавьте 20 микролитров протеиназы K.Mix методом вортексирования.

Поместите трубку в термоинкубатор и инкубируйте при встряхивании при температуре 56 градусов Цельсия в течение 60 минут. По окончании инкубации кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы удалить капли с крышки. Начните стирку, добавив 200 микролитров лизисного буфера и вортексируйте в течение 10 секунд.

Поместите пробирку в термомиксер и выдерживайте при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 минут. Поместите колонку неуловимости в новую двухмиллилитровую пробирку для сбора и выбросьте старую. Добавьте 500 микролитров буфера для промывки и центрифугируйте при 6000-кратной плотности в течение одной минуты.

Поместите колонку в новую двухмиллилитровую пробирку для сбора и выбросьте старую. Добавьте 500 микролитров промывочного буфера два и центрифугируйте при 6000-кратной плотности в течение одной минуты. Поместите колонку в новую двухмиллилитровую пробирку для сбора и выбросьте старую.

Центрифугируйте при 20 000-кратном течении силы тяжести в течение трех минут, чтобы высушить мембрану. Чтобы элюировать ДНК, поместите колонку в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и выбросьте пробирку для сбора. Поместите 50 микролитров дистиллированной воды на центр мембраны и выдерживайте при комнатной температуре в течение 10 минут.

Центрифугируйте пробирку при 20 000-кратном течении силы тяжести в течение одной минуты. Соберите элют и снова поместите в центр мембраны. Снова центрифугируйте пробирку при давлении в 20 000 раз в течение одной минуты.

Выбросьте мембрану. После измерения концентрации ДНК с помощью спектрофотометра храните ДНК при температуре минус 20 градусов Цельсия до использования. Для этой процедуры сначала собирается семь миллилитров образца периферической крови в семимиллилитровую пробирку без ЭДТА.

Оставьте образец крови для свертывания при комнатной температуре на 30 минут. Напишите код пациента в правом нижнем углу сберегательной карты. Центрифугируйте образец крови при 1100-кратном теперечне силы тяжести при комнатной температуре в течение 15 минут.

Извлеките надосадочную жидкость из трубки и переложите ее в новую 15-миллилитровую трубку. Осторожно повторно суспендируйте кровь пятимиллилитровой пипеткой. Сделайте пипетку и нанесите одно пятнышко сыворотки на сберегательную карту.

Повторите кровянистые выделения, чтобы получить в общей сложности от трех до пяти пятен крови. Оставьте высохшие пятна серотерапии на ночь при комнатной температуре с открытой крышкой сберегательной карты. На следующий день храните карту при комнатной температуре в полиэтиленовом пакете с влагопоглотителем до использования.

При хранении дольше 14 дней хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия. Подготовьтесь к анализу ИФА, разморозив DSS для каждого образца, если это необходимо. Чтобы вымыть белок из DSS, разрежьте один DSS на небольшие кусочки диаметром около одного миллиметра и положите кусочки в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем добавьте четыре микролитра PBS. Встряхните образцы на низкой скорости при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На следующий день используйте соответствующее разведение белка в качестве образца сыворотки для анализа секретируемого белка или фактора роста с использованием коммерчески доступного набора.

В этом протоколе образцы крови и сыворотки хранились в виде сухих пятен на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. До и после забора крови показывается репрезентативная карточка для сохранения белка. Чтобы подтвердить, что хранение на фильтровальной бумаге и процедура элюирования крови не влияют на качество образца, были проведены анализы ИФА на уровень белка, связывающего витамин D, или ДАД, на восьми образцах сыворотки, собранных в двухмиллилитровую пробирку и хранившихся сразу при температуре минус 80 градусов Цельсия или собранных в виде сухих пятен сыворотки.

Коэффициент вариации, или CV, между совпадающими образцами варьировался от 2% до 24%, а средний CV составлял 9,6%. После освоения этой техники ее можно выполнить за 10-15 минут, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены последующие методы молекулярной биологии или анализа белков. После своего развития эта методика позволяет исследованиям в области трансляционных исследований и анализа биомаркеров сотрудничать с институтами со всего мира, которые не имеют лабораторного оборудования для хранения биологических образцов в стандартных условиях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как правильно хранить образцы крови в засохших пятнах крови и сыворотке. Не забывайте, что работа с кровью и химическими реагентами может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторного халата.