Assay Берроуинг/туннелирования для выявления гипоксии в Drosophila melanogaster личинки

Общей целью этого анализа является идентификация личинок дрозофил, страдающих от гипоксии тканей, несмотря на нормальный уровень кислорода. У дрозофил есть много мутаций, которые приводят к медленному, плохому росту личинок и некоторой вялости личинок. Этот анализ идентифицирует в этом классе личинок тех, кто страдает от гипоксии тканей.

В конечном счете, этот анализ поможет выявить больше мутаций, которые вызывают дефицит кислорода в тканях в результате различных физиологических процессов. Идея этого анализа возникла из наблюдения, что личинки с поврежденными дыхательными путями или трахеей демонстрируют два странных поведения. Эти аномальные модели поведения заключаются в неспособности зарываться в пищу на ранних этапах жизни личинок и в неспособности проложить туннель в более мягкий субстрат во время фазы блуждания.

Настройте контрольные и экспериментальные генетические скрещивания в чашках для кладки яиц, как описано в текстовом протоколе. Держите мух в темноте не менее двух дней до начала сбора яиц по времени. Для своевременного сбора яиц переложите взрослых особей на новые пластины виноградного агара, украшенные свежим мазком дрожжевой пасты, в начале дня и дайте взрослым яйцам отложить яйца на тарелки в течение четырех часов.

Через четыре часа переложите взрослых особей в тарелки со свежим виноградным агаром. Затем инкубируйте четырехчасовые планшеты для сбора в течение ночи при температуре 25 градусов Цельсия. К следующему дню большая часть личинок уже вылупится.

Планируйте иметь не менее 50 человек на каждую экспериментальную группу. Для одного прогона анализа подготовьте не менее пяти пробирных пластин на каждую экспериментальную группу. Добавьте 16 грамм мухомора и 700 миллилитров деионизированной воды путем нагревания.

Приготовьте 17,5 миллилитров Нипагена в 95% этаноле. Нагревайте агаровый раствор до его почти полного растворения. Затем добавьте в раствор агара раствор Нипагена и нагревайте до полного растворения агара.

Немного остудите агаровый раствор, затем загрузите 10-сантиметровые пластины 15 миллилитров раствора агара. Как только агар загустеет, накройте пластины крышками и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение нескольких часов или на ночь. Вяленый агар должен быть твердым на ощупь и не осыпаться при вырезании из него кусочков.

Как только агар застынет, используйте пробковую доску длиной 1,5 сантиметра, чтобы сделать центральное отверстие в агаровом геле в каждой пластине. Затем заполните отверстия аккуратно свежей дрожжевой пастой. Чтобы перенести личинок на пробирную пластину, изготовьте простое средство.

Согните изгиб в кончике пластикового микрошпателя и окуните кончик в дрожжевую пасту, чтобы он стал липким к личинкам. Теперь подхватите по отдельности первых личинок возраста и положите их на агаровую тарелку поближе к пищевой горке. Для каждой опытной группы подготовьте не менее пяти пластин, в каждой по 10 личинок.

Для обеспечения воспроизводимости между репликациями анализа крайне важно, чтобы на каждой пластине было размещено только 10 личинок. Обязательно внимательно проверьте пробирную пластину, чтобы определить, что одна и только одна личинка передается каждый раз, когда вы доставляете личинку с помощью наконечника микрошпателя. Как только тарелка будет загружена, наклейте на нее этикетку, накройте крышкой, а затем поместите в темноту крышкой вверх при комнатной температуре.

Осматривайте каждую пластину ежедневно, пока все личинки не умрут или не окукливаются. Вот примеры планшетов для штамма дикого типа со второго по восьмой день анализа. На второй день личинки закапываются в пищу и туннелирование не происходит.

Прокладка туннелей начинается на третий день и достигает максимума между пятым и восьмым днями, когда личинки перестают бродить и окукливаются в своих туннелях. Аккуратно переложите куколки с помощью изогнутой дразнящей иглы на виноградную тарелку и при желании посчитайте, сколько куколок подложить. Обратите внимание на образование куколки и оцените куколки на наличие аномалий.

Чтобы изобразить туннели внутри пробирной пластины, сначала осторожно удалите и выбросьте всю дрожжевую пищу из центрального отверстия каждой тарелки. Затем аккуратно полейте каждую пластину водой из-под крана и с помощью мягкой кисти тщательно сотрите любой мусор, который был обнаружен на поверхности агара. Некоторые куски агара могут осыпаться там, где проходка туннелей наиболее интенсивна.

Это можно исправить позже. Продолжайте заменять воду несколько раз и аккуратно смахивайте мусор до тех пор, пока пластина не станет полностью чистой. Затем окончательно промойте тарелку деионизированной водой, накройте крышкой и дайте ей высохнуть при комнатной температуре в течение ночи.

Важно использовать мягкий поток воды и мягкие мазки щеткой для очистки агаровых пластин, чтобы вы не отламывали или не повреждали части агарового геля. На следующий день подготовьте изображение тарелки в формате tiff, используя черный фон, чтобы показать туннели в виде ярких белых линий. Системы документирования геля хорошо подходят для этого этапа.

Затем количественно оцените туннелирование на изображении с помощью Изображения J с помощью инструмента «Овал», определите агаровый гель до пластикового края пластины Петри, но не включая его. Затем примените автоматический порог для получения обратного изображения пластины, чтобы туннели отображались в виде черных линий. Чтобы исправить темные области, не содержащие туннелей, используйте инструменты «Палитра цветов» и «Кисть», чтобы осветлить эти области.

Затем в раскрывающемся меню Анализ выберите Установить масштаб и нажмите, чтобы удалить масштаб. Затем перейдите в окно Установить измерения в разделе Анализ и отметьте Площадь и Предел до порога. Теперь нажмите клавишу Control с клавишей M, чтобы получить измерение черной области на изображении в единицах пикселей, которые представляют туннельную область.

Чтобы количественно оценить потери при прокладке туннелей из-за эрозии агара вокруг центрального отверстия, снимите флажок Предел до порога. С помощью инструмента «Палочка» определите центральное отверстие и нажмите Control плюс M, чтобы измерить его значение в пикселях. Вычтите из этого значения значение пикселя отверстия диаметром 1,5 сантиметра.

Сложите разницу со значением пиксела, полученным ранее, чтобы получить общее значение пикселя туннелирования. Для пластин, в которых отсутствующий агар выходит за пределы центрального кольца тоннелирования, необходим дополнительный шаг, чтобы предотвратить включение областей за пределами центральной области при количественном определении. Используйте инструменты «Палитра цветов» и «Кисть», чтобы добавить черную полосу, как показано на рисунке, чтобы ограничить количественную площадь.

С помощью описанного анализа исследовали потенциальную гипоксию у личинок с нарушением функции ненадувного гена в трахах. Ген был подавлен РНК-интерференцией через Gal4 UAS. Использовались две линии Gal4.

Дыхание Gal4, которое проявляется через все развитие во всей системе трахеи. Или cut(ue)Gal4, который сильно проявляется в небольшом разрезе трахеи во время жизни личинки. Контрольные личинки содержали одну из линий Gal4, но не содержали ненадувной РНК-интерференции.

Личинки с cut(ue)Gal4, управляющими ненадувной РНК-интерференцией, были неотличимы от контрольной группы на протяжении всего развития как с точки зрения роста, так и с точки зрения поведения. Тем не менее, сильное подавление ненадувной РНК-интерференции по всей трахе с помощью blt-Gal4 приводило к неспособности закапываться в фазе кормления и приводило к высокой смертности. Эти личинки также показали полное отсутствие туннелирования во время фазы блуждания.

Кроме того, бездыханные экспериментальные личинки Gal4 были меньше, тоньше и медлительнее, чем контрольная группа, и оставались личинками долгое время после того, как все остальные группы окукливались. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проверять личинки дрозофил на гипоксию тканей, отслеживая степень, в которой они зарываются в свои пищевые холмики или туннелируют в мягкий субстрат. Полное отсутствие туннелирования является сильным показателем гипоксии тканей.