Экосистема изготовление (EcoFAB) протоколы для строительства лаборатории экосистем, предназначенных для изучения растений микробных взаимодействий

Общая цель данного протокола заключается в определении стандартизированных подходов к построению упрощенных модельных экосистем растений, называемых EcoFABs, которые позволяют проводить контролируемые, воспроизводимые лабораторные эксперименты для изучения взаимодействий микробов растений, которые могут быть дополнительно протестированы в полевых условиях. Этот метод может быть использован для изучения взаимодействия микробов растений в контролируемой среде, что позволяет нам получить подробное механистическое представление о функциях микробиомов, чтобы мы могли использовать их для устойчивого сельского хозяйства. Мы помогли разработать этот первый Eco-FAB, в котором используются различные доступные технологии 3D-печати и стерилизуются камеры для выращивания растений, что позволяет получать изображения с высоким разрешением и проводить химический анализ.

Разработанное здесь устройство Eco-FAB хорошо подходит для анализа взаимодействий микробов растений, поскольку оно включает в себя анализ морфологии корней и масс-спектроскопическую визуализацию. После конструирования пресс-форм Eco-FAB, с помощью 3D-печати по текстовому протоколу, в одноразовой литровой емкости смешайте 40 миллилитров силоксановой эластомерной основы с различными объемами отвердителя, в зависимости от эксперимента. Поместите контейнер в вакуумную камеру не менее чем на 30 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из эластомерной смеси.

Затем удалите смесь и залейте ее в собранную пластиковую форму, напечатанную на 3D-принтере. Чтобы создать однородный слой PDMS, пузырьки воздуха должны быть тщательно удалены. Используйте сжатый воздух для сдувания остатков воздуха после переноса смеси в форму.

Держите форму на нагревательном блоке при температуре 85 градусов Цельсия в течение четырех часов. Дайте форме остыть в течение пяти минут. Затем аккуратно вытащите вставку из формы и с помощью канцелярского ножа медленно отделите PDMS от литейной рамы.

Выдавите основание формы с помощью PDMS вверх из литейной рамы. Затем с помощью ножа или других инструментов аккуратно отделите слой PDMS от основания формы по краям и медленно снимите его с поверхности формы. С помощью тупой иглы 15 калибра создайте входной канал на слоях PDMS, проделав отверстия диаметром 1,6 мм в этой части.

Затем с помощью ножниц обрежьте края слоев PDMS. Чтобы прочно приклеить слои PDMS к предметным стеклам микроскопа, используйте метанол для промывки склеивающей стороны слоя PDMS на предметном стекле микроскопа размером 7,6 на пять сантиметров, а затем выдуйте их насухо сжатым воздухом или пистолетом для сверхчистого азота. Поместите предметное стекло микроскопа и слой PDMS в очиститель плазмы соединительными сторонами вверх.

Закройте камеру и клапан выпуска газа. Затем включите вакуум и откачайте камеру вниз в течение одной минуты. Включите питание плазменного генератора и переключите радиочастоту, или уровень радиочастоты, на высокий уровень на одну минуту.

Затем выключите вакуумный насос и питание плазмы и выпустите камеру в атмосферу. Извлеките предметное стекло микроскопа и слой PDMS из плазменной камеры и быстро прижмите все четыре края слоя PDMS к предметному стеклу с равномерным давлением. Следите за тем, чтобы центральная овальная область, которая является корневой камерой, не касалась предметного стекла.

Используя сверхчистую воду, промойте приборы Eco-FAB. Поместите одно устройство Eco-FAB в контейнер Eco-FAB и добавляйте 70% этанола до тех пор, пока устройство не будет погружено в воду. Затем закройте крышку контейнера и осторожно встряхните ее, чтобы смочить все поверхности внутри этанолом, убедившись, что камера для роста корней устройства Eco-FAB заполнена этанолом, в котором очень мало пузырьков воздуха или их нет.

После инкубации устройств при комнатной температуре в течение 30 минут слейте 70% этанол и замените его на 100% этанол. Затем инкубируйте устройства в течение пяти минут. После инкубации слейте воду с этанола и оставьте стерилизованный Eco-FAB в ламинарном колпаке на 16 часов, чтобы он полностью высох.

Если возможно, простерилизуйте систему, включив ультрафиолетовое излучение в вытяжке на один час. Чтобы провести стерилизацию семян и проращивание, замочите семена в 70%-ном этаноле на две минуты. Затем с помощью пипетки удалите этанол, и с помощью стерильной воды трижды промойте семена.

Далее замочите семена в 10% растворе хлорной извести на пять минут. Затем удалите раствор отбеливателя, и с помощью стерильной воды тщательно промойте семена три раза. После промывки добавьте к семенам стерильную воду, и инкубируйте пробирку при температуре четыре градуса Цельсия в течение семи дней.

Равномерно разложите семена по 0,5 Мурашиге и Скуга, или МС среднюю, с 0,6%-ным витагелем. И с помощью микропористой ленты заклейте пластины. Затем вырастите растения до длины корня около пяти миллилитров.

Чтобы пересадить рассаду в аппараты Eco-FAB, с помощью стерильного шприца или микропипетки и стерильной воды трижды промыть корневую камеру устройства Eco-FAB, а затем заполнить корневую камеру интересующей средой для выращивания, например, средой 0,5 мс. Теперь аккуратно вставьте один саженец в резервуар для растений устройства Eco-FAB. Важно, чтобы рассада была аккуратно перенесена с плиты на Эко-ФАБ, чтобы корни не сломались.

Добавьте в емкость три миллилитра стерильной воды, избегая устройства Eco-FAB. Это повысит влажность и уменьшит испарение среды из корневой камеры. Затем закройте контейнер и с помощью микропористой ленты запечатайте крышку.

Поместите Eco-FAB в растительный инкубатор или используйте систему освещения Eco-FAB в среде с контролируемой температурой, подходящей для роста соответствующего растения. Затем установите камеру на 24 градуса Цельсия. Наконец, проведите профилирование метаболитов и масс-спектрометрию, согласно текстовому протоколу.

На этих рисунках показаны семидневные Aaabidopsis thaliana, brachypodium distachyon и panicum virgatum, растущие в Eco-FABs. Было обнаружено, что как двудольный, так и однодольный доживают до стадии размножения в Eco-FAB. Эти сеянцы представляют собой группу 14-дневных брахиподиумных дистахионов, растущих в гидропонной среде, а также в песке и грунте с добавлением гидропонной среды и воды соответственно.

Тонкий, твердый слой субстрата и камеры для роста корней пропускают свет для микроскопической визуализации корневых систем. Здесь саженец brachypodium distachyon был перенесен в устройство Eco-FAB, а его корневая структура была зафиксирована камерой внутри тепловизора biorad gel. Количественная оценка общей площади корней в течение трех недель показала постепенное увеличение на ранней стадии, за которым следовал линейный тренд роста до конца.

На этом рисунке Eco-FAB, содержащий ризобактерии, способствующие росту растений, pseudomonas simiae, WCS417, был добавлен в корневую систему растений в количестве от 10 до 6 клеток на растение. Микробы WCS147 колонизировали поверхность всей корневой системы, а микробы концентрировались вокруг областей кончиков корней. При обновлении среды для выращивания и сборе корневых выделений из Eco-FAB важно помнить о том, что вся работа должна выполняться в стерильном колпаке, чтобы избежать загрязнения.

Устройства Eco-FAB также могут быть изготовлены с использованием обратимого физического уплотнения либо с помощью напечатанного на 3D-принтере зажима, либо путем изменения вязкости PDMS. Это позволяет использовать твердые питательные среды и прямую масс-спектроскопическую визуализацию. После разработки Eco-FAB эта система позволит исследователям по всему миру использовать эти лабораторные модельные экосистемы для изучения взаимодействия микробов растений с использованием технологий системной биологии и визуализации.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготовить систему Eco-FAB, а также о ее широком применении в исследованиях экосистем. Мы надеемся, что этот проект Eco-FAB позволит другим ученым достичь своих конкретных научных целей. Что еще более важно, мы надеемся, что другие ученые будут опираться на этот проект Eco-FAB и улучшать его, а также делиться им с другими учеными, чтобы мы, как сообщество, могли построить эти лабораторные экосистемы, которые позволят нам лучше понять взаимодействие растительных микробов.

Не забывайте, что работа с микробами и острыми предметами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.