Образования ковалентной ДНК аддукты ферментативно активированные канцерогенов и наркотиков в пробирке и их решимость по ³²P-postlabeling

Общей целью данного протокола является описание методов, использующих реакции, катализируемые цитохромом р450 и дополнительными ферментами биотрансформации, для исследования активности химических веществ или лекарств для их активации метаболитами с образованием ковалентных аддуктов ДНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития рака и его лечения. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она показывает вам тип метода оценки эффективности химических веществ окружающей среды или лекарств для формирования ковалентных аддуктов ДНК, представляющих начало развития рака.

Последствия применения методики определения канцерогенной активности химических веществ. Потенция окружающей среды, токсиканты и лекарственные препараты, а также определяет относительно простые методы образования ковалентных аддуктов ДНК, образуемых такими соединениями. Хотя этот метод может дать представление о начале развития рака и его лечении, он также может быть применен в других научных областях.

Например, исследования молекулярных механизмов, повреждений ДНК, а также пероральные исследования ферментативной активации и токсикации химических веществ. Впервые я услышал об идее этого метода, когда исследовал процессы, связанные с фазой инициации химического канцерогенеза. Сначала приготовьте инкубационную смесь, добавив все соединения и ферментные системы до конечного объема 0,75 миллилитра при четырех градусах Цельсия.

Это делается для инкубации канцерогена с ДНК в присутствии цитохрома р450. Затем добавьте в смесь микросомы или чистый рекомбинант p450 в суперсоме. Далее добавьте 7,5 микролитров растворенного в ДМСО 0,1 миллимоляра эллиптицина, и 42,5 микролитра воды, чтобы довести итоговый объем до 0,75 миллилитров.

Затем смешайте компоненты, вортексируя трубку в течение пяти секунд. Сразу после этого инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия с открытой крышкой в течение 30-60 минут. Затем смешайте фенол или фенолхлороформ в соотношении один к одному с инкубационной смесью в пробирке Eppendorf.

Это удалит белковое загрязнение из ДНК в инкубационной смеси. Затем перемешайте смесь до образования эмульсии. Затем закрутите смесь при 1600 умноженных на г в течение трех минут при температуре окружающей среды.

После завершения центрифугирования используйте пипетку для переноса верхней водной фазы в новую полипропиленовую трубку. Затем отбросьте белковую границу раздела вместе с органической фазой. Далее смешайте водную фазу с эквивалентным объемом фенола и хлороформа в соотношении один к одному.

Затем повторите центрифугирование. Далее добавьте равные объемы хлороформа в собранную водную фазу и снова центрифугируете. Затем осаждайте ДНК из водной фазы, добавив два объема холодного этанола, поддерживаемого при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Затем хорошо перемешайте раствор. Чтобы подготовиться к мечению аддуктов ДНК, смешайте буферный раствор бицина с раствором АТФ, меченным радиоактивными веществами, для мечения аддуктов ДНК. Добавьте маркировочную смесь в раствор NP1, или смесь для обогащения бутанолом.

Дайте смеси настояться при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем нанесите примерно 20 микролитров на весь образец на пластину PEI-целлюлозы TLC. После обнаружения образца на пластине TLC из PEI-целлюлозы, оставьте пластину для проявления в направлении D1 для очистки аддуктов.

Как только пластина высохнет, оставьте пластину для проявления в направлениях D3 и D4. Для проявки в D3 используют буфер на основе формиата лития при pH 3,5 с мочевиной. Для проявки D4 используют буфер Tris-HCl с хлоридом лития и мочевиной.

Чтобы избежать проблем с проявкой в направлении D4, проявляйте пластины также и в направлении D5. Во-первых, метод пост-мечения P32 используется для изучения эффективности микросомального биоактивированного эллиптицина, опосредованного p450, в формировании аддуктов ДНК. Результаты показывают образование ковалентных аддуктов ДНК деоксигуанозина ДНК тимуса теленка в присутствии микросом печени крысы и/или человека; Однако в контрольной группе аддуктов не образуется.

Далее изучается потенциал фермента пероксидазы, зависимого от активированного эллиптикина. На изображении показано образование ковалентных аддуктов ДНК тимуса теленка в присутствии пероксидазы хрена, лактопероксидазы крупного рогатого скота и миелопероксидазы человека. На самом деле, аддукты ДНК также образуются из ДНК печени, когда крыс обрабатывают 40 миллиграммами эллиптицина на килограмм массы тела in vivo.

Интересно, что фермент цитохрома p450 человека CYP3A4 также демонстрирует сильный потенциал эффективного окисления эллипттицина до метаболитов, таких как 12-гидроксиэллиптин и 13-гидроксиэллитицин. Эти метаболиты могут легко связываться с ДНК с образованием аддуктов. Затем с помощью методов обогащения нуклеазой P1 и n-бутанолом изучено образование аддуктов ДНК при активации 3-нитробензантрона цитозольной редуктазой, такой как NQ01, у крыс и человека.

Результаты показывают образование до пяти аддуктов ДНК тимуса теленка, полученной от крысы, цитозоля печени человека, а также печени мышей. После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о стабильности используемых ферментативных систем.

Активность фермента может снизиться, если его не хранить на льду. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биохимии, биохимии химического канцерогенеза к изучению природы явления инициации процессов развития рака у организмов. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как оценить эффективность химических веществ или лекарств из окружающей среды, которые должны быть ферментативно активированы для метаболизма генетических ковалентных аддуктов ДНК.

Этот процесс имеет большое значение для разработки методов лечения рака. Не забывайте, что вы работаете с химическими веществами, которые могут быть чрезвычайно опасными. Потенциальные канцерогены, радиоактивные химические вещества, например, фосфор АТФ.

Поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как лабораторные латексные перчатки и листы из оргстекла.